DNA提取中的常见问题分析_精品文档Word文档格式.docx
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在提取液中加入0.35倍体积的无水乙醇,迅速混匀,多糖会先沉淀。
3、沉淀DNA时,使多糖保留在溶液中。
如用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5mol/LNaCl,或加NH4Ac使终浓度为10mmol/L。
或0.5mLDNA液中加0.125mL4mol/LNaCl和0.625mL13%PEG8000(冰浴1h)。
4、多糖和DNA的共沉淀物进行再分离。
如用TE缓冲液反复清洗共沉淀物,将清洗液合并再用醇沉淀DNA,或将沉淀物溶解后,经琼脂糖电泳,切下DNA部分再将胶回收,或者用多糖水解酶将多糖降解。
还有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖。
上述方法还可组合使用,以达到最佳效果。
然而这些方法均会在一定程度上减低DNA的提取量;
如果材料较少或要求较高,则可考虑用柱层析方法,使用对DNA具有特异性吸附的树脂来纯化DNA。
曾有文献提到选用WizardPurificationKit,PRC-5柱,SephacrylS-1000或S-500,QiagenGenomictip500/G,或者CsCl梯度离心纯化DNA。
血样4度保存了2月,现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA,有什么解决办法?
按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来,下面是参考方法:
1、首先洗出白细胞,最好有1毫升以上血液。
2、加入5mlDNA提取缓冲液,(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。
3、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀,50℃水浴过夜。
4、用等体积的(酚,氯仿,异戊醇,25:
24:
1)混合物抽提一次,5000r/min,10min离心收集水相。
5、取水层,加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min,10min,75%乙醇5000r/min洗DNA,充分干燥将DNA溶于适量水中。
CTAB法提取水稻基因组DNA,TE溶解后琼脂糖胶电泳检测,点样孔附近有一条明显的主带。
用MBI公司产的限制性内切酶酶切过夜,鉴定时发现DNA已经被完全切烂,只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。
换用NEB公司产的酶,更换EP管,灭菌水之后重复几次,结果还是如此。
拿其他人的DNA做对照,酶切结果正常。
用异丙醇将DNA重新沉淀,换了TE溶解,检测主带仍旧清晰,可是用酶切之后DNA还是被切烂。
为什么?
1、公司的酶不行。
2、如做酶切,DNA最好不用异丙醇(因其不易挥发)而用无水乙醇沉淀。
3、酶量大或作用时间太长了。
建议重提DNA,取少许用超纯水溶解(非TE),按照说明书进行酶切。
要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。
这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解;
要得到全血基因组DNA,可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗?
这样做,与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异?
1、觉得还是先分离细胞好,因为DNA和RNA大都是在细胞核内,有红细胞反而不太好。
从血里面提RNA,用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的,效果还是不错的。
2、现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA,用密度梯度离心,只是富积淋巴细胞,能得到更多的DNA而已。
一般如果DNA的量的要求不太多的话,没必要。
3、如果对基因组的要求不高,可以试试这个方法。
取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5mlEppendorf管中,加无菌重蒸水500μl;
10000r/分钟离心3分钟,弃净上清;
加20μl5mol/LKI,旋涡振荡30秒;
0.9%NaCl100μl,150μl氯仿/异戊醇(24∶1),振荡30秒;
10000r/分钟离心5分钟,吸上清100μl于另一Eppendorf管中,加异丙醇60μl,轻轻混匀,10000r/分钟离心5分钟,弃上清;
加冷无水乙醇1000μl,10000r/分钟离心5分钟;
弃去无水乙醇,37℃烤干;
50μl无菌重蒸水或TE,混匀溶解备用。
从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗?
可以的,国外有好多相关试剂盒,qiagen,roche等公司都有的。
100ml的大量提取,蛋白酶K是必需的吗?
它的作用是什么?
用溶菌酶代替可以吗?
每次在用酚氯仿异戊醇抽提后,上层里面都是絮状的蛋白质,离心几次都沉淀不下来,请问是哪里出了问题?
一般来说,蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。
而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁,二者作用各异,不可替代。
对于实验中的蛋白问题,建议离心后先用竹签挑出蛋白,小心吸取上层清液,再重复抽提几次试试。
一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K,这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化,不是很难除去吗?
那DNA是不是不纯?
可以用来酶切吗?
蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白,而是消化细胞,在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的,植物细胞的较易破碎,不需要蛋白酶k的作用。
protenaseK作用:
1、消化组蛋白,释放出DNA。
2、消化DNAse,提高DNA分子量。
建议还是加蛋白酶k为好,这样提出来的DNA分子量会高一点,且更纯。
提白粉孢子的总DNA,白粉孢子比较小,直接在研磨中加液氮研磨可以吗?
液氮研磨的方法应该可行的,做动物组织,植物组织多采用这种方法,植物纤维一样可以用液氮研磨,要有耐心,边加液氮边研磨,研磨好后再抽提,应该是可以的。
在CTAB法提取DNA时,有一些品种没有DNA析出,是什么原因?
1、用预冷的异丙醇来沉淀试试,同时研磨的时候要研的非常非常的细。
2、没有看到析出物并不代表没有沉淀,可以继续下一步试验,溶解的时候少加一点儿。
3、高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。
可能DNA就这样留在沉淀里了。
提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,怎样更好的抑制内源核酸酶的活性?
在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。
用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取,虽然总DNA提出来了,可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来,请有没有什么好的办法可以解决这个问题?
环境特别是土壤的样品成分复杂,尤其是有腐殖酸具有和DNA类似的性质,因此用一般的国内试剂盒无法提纯。
应当选用自制的提取方法,在裂解液中加入要加入PVP。
洗涤后硅胶膜上仍有杂色残留?
细胞裂解不充分,裂解液和样品要快速充分混匀。
洗涤产物中DNA量很少或没有?
1、样品中细胞或者病毒浓度低。
2、裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分。
3、蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分。
4、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全,尽量把组织切成小块,延长温浴时间,使裂解物中没有颗粒状物残留。
5、在上柱前,裂解物中没有加乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇。
6、DNA没有有效洗脱,提高洗脱效率,可将离心柱在加入洗脱液后在室温静止至少1min,再离心。
7、洗脱液pH不合适,低pH值会减少DNA产率,确保洗脱液pH在7.0-8.5之间。
8洗脱体积太大,超过200ul洗脱体积所得的DNA浓度会降低,但DNA总量不会减少。
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