微生物限度检查操作规程中国药典15版四部通则Word文档格式.docx
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三、目录1.微生物限度标准
2.设备、仪器及用具
3.消毒液、稀释剂、试液及培养基
4.检查总则(通则1105:
非无菌产品微生物限度检查:
微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:
控制菌检查法)
5.微生物计数法检查
6.控制菌检查法
7.实验技术
8.附件
1.微生物限度标准
非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准
需氧菌总数(或)
霉菌和酵母菌总数(或)
控制菌
药用原料及辅料
103
102
*
*未做统一规定。
1.1成品微生物限度标准
品名
法定标准
内控标准
大肠埃希菌
沙门菌
乳糖
≤1000
≤100
—
无
≤50
无水乳糖
≤10
—/10g
—/100g
蔗糖
(1).“—”为不得检出。
(2).目测霉变者以不合格论。
(3).“无”为标准依据或无相应规定。
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1.2工艺用水微生物限度标准
需氧菌总数()
控制菌(100或100)
生活饮用水
不得检出
纯化水
≤
≤80
1.3内包装材料微生物限度标准
品名
(单位)
需氧菌总数
霉菌和酵母菌总数
药用聚乙烯烃塑料袋(1002)
说明:
1.“—”为每1002中不得检出。
2.目测霉变者以不合格论。
3.“无”为标准依据或无相应规定。
2.设施、仪器及用具
2.1、设施:
2.1.1.微生物限度检查室及相关设施:
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
2.1.2.其他设备:
高压蒸汽灭菌器;
细菌培养箱(30~35℃);
霉菌培养箱(25~28℃);
电炉(或其他适宜的加热装置);
恒温水浴;
电热干燥箱(250~300℃);
电冰箱。
生化试剂储存箱。
2.2仪器及器皿
2.2.1.菌落计数器;
显微镜(1500X);
电子天平或药物天平(感量0.1g);
系列比色计。
2.2.2.玻璃器皿:
锥形瓶(250~300,内装玻璃珠若干)、研钵(玻璃或陶瓷制,∮10~12)、培养皿(∮9)、量筒(100)、试管(18×
180)及塞、吸管(1分度0.01,10分度0.1)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸(带盖)。
2.2.3新购的玻璃器皿的清洁:
先用流水冲洗,浸泡于12%盐酸(工业用)液中约2~6小时,除去游离碱质,再用流水冲洗。
用于化学分析的玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后,再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2~3次,晾干备用。
2.3用过的玻璃器皿:
2.3.1未被病原微生物污染的器皿:
可随时洗涤。
用清水冲洗(或浸泡),除容量仪器外,可用毛刷和肥皂粉,内外刷洗,再用清水涮洗干净,晾干备用。
容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗,再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2~3次。
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2.3.2已被病原微生物污染的器皿:
需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。
试管及培养皿:
先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经121℃灭菌30分钟。
趁热倾出培养物,再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。
吸管:
全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中,筒底应衬有棉或橡皮垫,以防管尖损坏。
24小时后,逐支用流水反复冲洗洁净,晾干后包扎灭菌备用。
载、盖玻片:
应分别浸泡于清洁液12~24小时后,取出用流水冲洗,再放入35%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10~15分钟,待自然冷却后,再用流水冲洗。
沥干后置95%乙醇中浸泡,晾干备用。
2,3,3玻璃器皿用前应洗涤干净,无残留抗菌物质。
吸管口上端距0.5处塞入约2的适宜疏松棉花,置吸管桶内或牛皮纸袋中。
锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞,若用振荡器制备混悬液时,尚需用玻璃纸包裹瓶塞(以免振荡时供试液污染瓶塞),再用牛皮纸包扎。
玻璃器皿,均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30分钟,烘干备用。
2.4用具
2.4.1大、小橡皮乳头(放于干净带盖的容器中,并应定期用7075%乙醇溶液浸泡)。
2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套(洗净后配套,用牛皮纸包严)灭菌,备用。
也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
2.4.3接种环(白铱金或镍铬合金,环径4~5、长度6~10)、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖(12)、实验记录纸等。
3消毒液、稀释剂、试液及培养基
3.1消毒液、稀释剂及试液。
3.1.10.1%苯扎溴铵溶液:
供洗手、擦拭操作台面用。
3.1.25%石碳酸溶液:
配制后装入玻璃消毒缸内,供消毒带菌吸管用,抑或选用其他适宜消毒液。
3.1.3.75%乙醇溶液:
配好后制乙醇棉球,供擦手、擦拭操作工具用。
3.1.4.0.9%无菌氯化钠溶液:
取氯化钠9.0g,加水使溶解成1000,121℃灭菌20分钟。
3.1.5.司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-80:
供非水溶性供试品供试液制备用。
3.1.6.无菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液():
取氯化三苯四氮唑0.1g,加水使溶解成10。
3.1.7.甲基红指示液:
取甲基红0.1g,加入95%乙醇300,水适量,使溶解,再加水至500。
3.1.8.试液:
①氢氧化钾试液:
取氢氧化钾40.0g,加水使溶解成100;
②α-萘酚乙醇试液:
取α-萘酚6.0g,加无水乙醇使溶解成100。
3.1.9.革兰染色液:
①沙黄染液:
取沙黄0.25g,加95%的乙醇10,使完全溶解后,加水至100;
②结晶紫染液:
取结晶紫1.0g,加95%的乙醇20,使溶解,加1%的草酸铵溶液80,混匀。
静置48小时使用,置密闭棕色瓶中储存;
③碘试液:
取碘化钾2.0g,加水3~5使溶解,加入碘片1.0g,使全部溶解后,加水稀释至300,置密
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闭棕色瓶中储存。
3.1.10.中性红指示液:
取中性红1.0g,研细,加95%乙醇60,使溶解,再加水到100。
变色范围6.8~8.0(红→黄)。
3.1.11.亚甲蓝指示液:
取亚甲蓝0.5g,加水使溶解成100。
3.1.12.溴麝香草酚蓝指示液:
取溴麝香草酚蓝0.4g,加1氢氧化钠溶液0.64使溶解,再加水至100。
变色范围6.0~7.6(黄→蓝)。
3.1.13.酸性品红指示液:
以酸性品红0.5g,加水100使溶解,再逐渐加1氢氧化钠溶液16,每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴,直至溶液呈草黄色;
于沸水内保持15分钟,再静置2小时,滤过,即得。
优点:
无色,在倒管内早期发酵易观察,不易被还原。
变色范围6.0~7.4(红→黄)。
3.1.14.曙红钠指示液:
取曙红钠2.0g,加水使溶解成100。
3.1.15.靛基质试液:
取对二甲氨基苯甲醛1.0g,加入95%乙醇95,充分振摇,使完全溶解后,取浓盐酸20徐徐滴入,边加边振摇,以免骤热导致溶液色泽变深,置
冰箱保存,备用。
3.2培养基
3.2.1.培养基的制备及储存
3,2,1,1溶化:
一般应放在玻璃器皿或搪瓷器内。
加入纯化水,隔水加热以促其溶解,加热时应经常搅拌,防止焦结,待其溶解后补足水分。
3.2.1.2在使用干燥培养基时,先将纯化水按定量加入容器中,然后称取一定量培养基干粉放入水中,静置10~15分钟,搅拌,振荡,或延长时间以促进溶解,一般不要加热,必要时加热,但时间不宜过长,温度不宜过高,避免某些营养成分被破坏。
3.2.1.3校正酸碱度:
培养基必须有适当的值。
测定值是培养基配制过程中的重要步骤之一,干燥培养基一般已校正过值,用时也必须再验证。
值测定时,一般用指示剂滴入培养基中观察其颜色的变化,或用计校正,如与所需值不符,可用酸或碱液加以校正。
一般用氢氧化钠校正的弱碱性培养基,高压灭菌前培养基的值高0.2左右,灭菌后基本合适。
调整值后要加热过滤,使培养基澄清。
3.2.2培养基的分装:
3.2.2.1液体、半固体培养基一般在高压灭菌前分装,约装试管容积的1/3,在灭菌后还要加入成分的液体、半固体培养基,灭菌后再分装于灭菌试管或锥形瓶中。
3.2.2.2固体培养基一般分装在250、500锥形瓶中,高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。
平皿:
如倾注平皿,应在无菌室中放置3~4小时,如用塑料平皿须在35℃培养箱中倒置30~60分钟。
水蒸气会自然蒸发。
斜面:
制备低层斜面分装于试管,约占容积的1/5,灭菌后趁热斜放于细玻璃棒和木杆上,使成斜度,分装时注意管口和瓶塞上勿沾有培养基,避免污染。
制备高层斜面分装于试管,约占试管容积的1/3,灭菌后趁热放置成高层短斜面,待其凝固后应用。
3.2.3培养基的灭菌:
培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌,各种培养基的灭菌时间和压力,按其成分不同而定。
普通培养基多采用121℃、103.42灭菌15分钟,但容器和装量较大时,可延长至20分钟。
高压灭菌应严格按照操作规程进行,必须逐渐加热,彻底排除灭菌器内的冷空气,再逐渐升压保持预定的压力和时间,达到全杀灭微生物的目的。
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3.2.4培养基的储存:
保存培养基的时间需视培养基中水分蒸发的程度及有无污染而定,已制备好培养基要保存于冷暗处或冰箱中,但由于各种培养基的性质不同,不可能
固定一个保存期限。
制备好的平板或试管培养基,为防止水分蒸发,应置于塑料袋内,4℃保存,可延长使用期限。
微量生化反应管熔封于细玻管内,室温下可保存1年左右。
3.3注意事项:
3.3.1采用干燥培养基时,按说明配制,应对灭菌后的培养基值进行校验。
若为自配培养基,原料应挑选,琼脂凝固力应测定,以确定配制时琼脂的用量。
试剂规格要求应为化学纯()以上规格,其中不能含有对细菌、霉菌、大肠杆菌生长有害的抑制物。
3.3.2配制的培养基不应该有沉淀,如有沉淀,应于溶化后趁热过滤,并应于2小时内灭菌,避免细菌繁殖。
3.3.3培养基的分装量不得超过容器的2/3,以免灭菌时溢出。
包装时,塞子必须塞
紧,以免松动或脱落造成染菌。
3.3.4配制培养基的值测定时,其波动范围应在规定的±
0.2之内,还需注意高压灭菌后的值变化。
3.3.5
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- 微生物 限度 检查 操作规程 中国 药典 15 四部 通则