细胞总蛋白提取方法.doc
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细胞总蛋白提取方法.doc
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细胞总蛋白提取方法
一、溶液配制
1.100mMNaF(NaFMW=41.99)10ml
称取NaF41.99mg,超纯水8ml溶解后定容至10ml。
2.100mMPMSF
3.RIPA溶液100ml
成分
分子量
终浓度
Tris
121.14
0.6g
5.0mM(pH7.4)
NaCl
58.44
0.87g
150mM
EDTA
372.24
37.22mg
1mM
NP-40
1ml
1%
SDS
0.1g
0.1%
脱氧胆酸钠
0.5g
0.5%
溶解于80ml超纯水中,待溶解后加入HCl调pH值至7.4,定容至100ml。
※使用前加入
成分
储存浓度
加入量
终浓度
PMSF
100mM
10μl/1ml
1mM
NaF
100mM
10μl/1ml
1mM
Aprotinin
10μg/μl
0.2μl/1ml
2μg/μl
Leupetin
10μg/μl
0.2μl/1ml
2μg/μl
二、方法
1.细胞收取
1)细胞传代至60mm培养皿中,待细胞融合约100%,收集细胞
2)弃培养基,加入PBS2ml清洗培养皿一次,弃PBS。
分两次将细胞收至一个管中
3)加入0.05%胰酶2ml,37℃温育1min。
4)待细胞变形后,将细胞吹下转移至一个1.5ml
ependorf管中,10,000rpm×3min,4℃
5)弃上清,1ml预冷的PBS清洗沉淀,10,000rpm×3min,4℃
6)重复PBS清洗一次
7)弃上清,-80℃冻存待裂解
2.蛋白提取
加入缓冲液前先将细胞沉淀敲散,加入后吹打细胞沉淀使其松散
1)向细胞沉淀中加入200μlRIPA缓冲液(含1mMPMS、
1mMNaF、2μg/mlAprotinin、2μg/mlLeupetin),混匀
后冰上放置40mins
2)10,000rpm×15min,4℃
将上清转移至一个新的ependorf管中(约250μl)
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