中国药科大学生物制药基本工艺实验指导文档格式.docx
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交联可以是细胞通过离子互相作用或共价连接到一种表面,也可以是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接;
吸附法是细胞通过静电互相作用(范德华力、离子键和氢键)吸附到支持物表面,此法简朴价廉,但经常发既有细胞泄露;
絮凝法是运用某些微生物细胞具备絮凝形成颗粒能力而对细胞进行固定化办法;
包埋法是近年来发展迅速一种新兴固定化细胞技术,它是将细胞捕获在一种保护性基质构造或胶囊中,减少了细胞泄露,因而具备操作简朴,对细胞活性影响较小,效率高等特点,是当前细胞固定化研究和应用最广泛办法之一。
L-天冬氨酸(L-Asparticacid)是天然存在重要氨基酸,在食品、医药、日用化工、纺织等行业有着广泛应用。
L-天门冬氨酸钾、镁盐在细胞代谢中起着重要作用,是钾、镁有效补充剂,合用于各种心脏病。
在食品方面,L-天冬氨酸作为食品添加剂可改进食品风味,L-天冬氨酸与D-丙氨酸可合成L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯(其甜度为蔗糖150倍),是一种新型甜味剂。
在化工方面,L-天冬氨酸还可以作为制造合成树脂原料,其衍生物还可以合成量型表面活性剂以及制造化妆品。
工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法。
随着固定化酶和固定化细胞技术不断完善和发展,人们开始改用具有天冬氨酸酶固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产。
L-丙氨酸(L-Alanine)是一种脂肪族非极性氨基酸,是丙酮酸代谢体系非必须氨基酸,在血液中含量最多,与糖代谢密切有关,使转氨反映中重要氨基供体,具备重要生理功能;
同步又是一种重要氨基酸类药物,为各种复方氨基酸输液重要构成成分,并可作各种医药中间体。
本实验用卡拉胶包埋天冬氨酸酶产生菌和L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌制成固定化细胞,运用生物反映器,可持续生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸。
【实验材料】
1.器材
(1)水浴振摇培养箱1台
(2)磁力搅拌器1台
(3)HPLC1台
(4)三角烧瓶250ml5个
(5)抽滤瓶1个
(6)离心机1台
(7)布式漏斗2只
(8)恒温水浴锅1台
(9)酶柱1根
(10)烧杯1000ml1个
(11)烧杯500ml2个
(12)烧杯250ml2个
(13)超级恒温水浴1台
(14)恒流泵1台
(15)高压灭菌锅1个
(16)锋利小刀1把
(17)试管12支
2.试剂
(1)菌种
(2)玉米浆
(3)延胡索酸铵
(4)PLP(5-磷酸吡哆醛)
(5)牛肉浸膏
(6)KH2PO4
(7)MgSO4·
7H2O
(8)浓氨水
(9)氯化钾
(10)氯化镁
(11)浓硫酸
(12)95%乙醇
(13)L-天冬氨酸原则品
(14)延胡索酸原则品
(15)L-丙氨酸原则品
【实验办法】
1.细菌培养及菌体制备
接种1ml对数生长期天冬氨酸酶产生菌种至250ml三角烧瓶中,内含50ml已经灭菌培养基(1%延胡索酸铵,2%玉米浆,2%牛肉浸膏,0.5%KH2PO4,0.05%MgSO4•7H2O,pH7.0),37℃振摇培养24h,培养液离心(3000r/min,20min)倾出上清液,再用生理盐水洗涤1次,离心收集菌体,置冰箱备用。
接种1ml对数生长期L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌种至250ml三角烧瓶中,内含50ml已灭菌培养基(1.5%L-谷氨酸钠,0.5%富马酸铵,1%富马酸钠,3.0%玉米浆,2%蛋白胨,0.05%KH2PO4,0.01%MgSO4•7H2O,pH7.0),37℃振摇培养24h,培养液离心(3000r/min,20min)倾出上清液,再用生理盐水洗涤一次,离心收集菌体,置冰箱备用。
2.固定化细胞制备
(1)天冬氨酸酶产生菌固定化
将4g湿菌体悬浮于4ml生理盐水中,置45℃恒温水浴保温,0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中,加热至70-80℃使之溶解,再降温至45℃,两者于45℃混匀,混合物置4℃冰箱放置30min,将凝胶在100ml0.3mol/LKCl溶液中浸泡4h,然后切成3mm×
3mm×
3mm立方体颗粒。
经生理盐水洗涤后,将固定化细胞置于1mol/L延胡索酸铵中,于37℃活化24h,即可使用。
(2)L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌固定化
将5g湿菌体悬浮于5ml生理盐水中,置45℃恒温水浴保温,0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中,加热至70-80℃使之溶解,降温至45℃,两者于45℃混匀,混合物置4℃冰箱放置30min,将凝胶在100ml0.3mol/LKCl溶液中浸泡4h,然后切成3mm×
用0.1mol/L甘氨酸充分洗涤,在1mol/L天冬氨酸铵(含0.1mol/LPLP)底物中,于37℃活化24h,即可使用。
3.酶活力测定
(1)湿菌体天冬氨酸酶活力测定
取0.5g湿细胞悬浮于2ml蒸馏水中,加入30ml1.0mol/L延胡索酸铵,内含1mmol/LMgCl2,1%TritonpH9.0,37℃搅拌反映30min,煮沸终结反映,1200rpm,5min离心后,稀释反映上清液于240nm处测定吸取值,按延胡索酸残存量计算酶活力,一种酶活力单位定义为在测定条件下,每小时每克细胞转化生成1µ
mol天冬氨酸所需酶量。
(2)固定化细胞天冬氨酸酶活力测定
取相称于0.5g天然细胞固定化细胞,置于30ml1.0mol/L延胡索酸铵,内含1mmol/LMgCl2,37℃搅拌反映30min,迅速过滤除去固定化细胞,分离反映液,经稀释后于240nm处测定延胡索酸残存量,并计算每克固定化细胞酶体现活力。
总活力用每克固定化细胞,单位小时内所产生L-天冬氨酸微摩尔数表达(µ
mol/h·
g·
cell)。
(3)延胡索酸(即富马酸)原则曲线绘制
延胡索酸在240nm处有特性峰吸取,在一定范畴内与延胡索酸含量成线性关系,且反映系统中无干扰。
原则曲线绘制
试管号
1
2
3
4
5
6
延胡索酸原则液(50µ
g/ml)
蒸馏水
OD240nm
依照测定吸取值,作出原则曲线或回归方程。
(4)湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力测定
取1g湿菌体悬浮于10ml生理盐水中,取0.5ml悬浮液,加入含0.1mmol/LPLP1mol/L天冬氨酸铵底物2ml(pH6.0)于37℃反映30min,煮沸终结反映。
生成L-丙氨酸用纸层析法定量测定。
展开剂选用正丁醇:
醋酸:
水=4:
1:
1,显色剂用0.5%茚三酮溶液,烘干后,将显色斑点剪下用0.1%CuSO4·
5H2O:
75%乙醇=2:
38洗脱后,于520nm处比色,再从原则曲线上读得L-丙氨酸含量。
L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力定义为:
每克细胞每小时生成1µ
mol/L-丙氨酸为1个酶活力单位(U)。
(5)固定化细胞L-天冬氨酸β-脱羧酶活力测定
取6g固定化细胞(相称于1g湿细胞)加入20ml生理盐水,于37℃保温,加入含0.1mmol/LPLP1mol/LL-天冬氨酸铵4ml,pH6.0,于37℃反映30min,迅速过滤除去固定化细胞,分离反映液,生成L-丙氨酸用纸层析法定量测定。
(6)L-丙氨酸原则曲线绘制
按(5)法用纸层析法定量测定L-丙氨酸含量与显色斑点脱色后在520nm处比色关系。
原则曲线绘制
L-丙氨酸原则液(40µ
OD520nm
4.L-丙氨酸制备
分别将6g天冬氨酸酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶固定化细胞装入带夹套固定化生物反映器内(Φ1.5cm×
30cm),1.0mol/L延胡索酸铵(含1mmol/LMgCl2,pH9.0)底物,以恒流速度通过天冬氨酸酶固定化细胞柱,SV=0.87h-1,然后将流出液通过L-天冬氨酸β-脱羧酶固定化细胞柱,并加0.1mmol/LPLP和28%氨水,使pH6.0,流出液用纸层析法计算L-丙氨酸量,并计算转化率(L-丙氨酸转化率=L-丙氨酸浓度/延胡索酸铵浓度×
100%)。
【思考题】
1.分别求出湿菌体天冬氨酸酶活力、固定化细胞天冬氨酸酶活力及湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力、固定化细胞L-天冬氨酸β-脱羧酶活力。
2.分别求出两种菌体包埋后活力回收率。
3.分别求出L-天冬氨酸和L-丙氨酸转化率。
第二节多肽及蛋白质类药物
实验二十三重组水蛭素Ⅲ制备
此实验内容来自校企合伙课题,某些成果已申请专利
1.理解以基因工程菌种E.coli/pHV3为材料进行工程菌发酵培养、外分泌表达小分子多肽类药物重组水蛭素Ⅲ及表达蛋白制备和抗凝血酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定工作原理。
2.掌握基因工程菌发酵培养条件、分泌表达目蛋白及表达蛋白分析鉴定操作技术办法。
水蛭素(hirudin)是一类由医用水蛭(Hirudo)唾液腺中分泌出低分子量酸性单链多肽,19,Markwardt一方面将其分离纯化,并于1970年拟定它是迄今发现最强凝血酶特异性抑制剂,虽然在较低浓度也可充分地制止血液凝固。
药理学及临床研究表白,水蛭素能有效地防止静动脉血栓形成及弥散性血管凝结,不引起过敏、免疫反映,不会导致循环功能障碍。
可用于治疗不稳定性心绞痛(USA)、急性心肌梗死(AMI)、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血(DIC)等,是较好抗凝抗栓药物。
水蛭素分子质量约为7000Da,具有65~66个氨基酸残基,水蛭素肽链二级和三级构造对其抗凝活性起决定性作用,其N端3个二硫键则是决定分子二级和三级构造及其稳定性核心,将二硫键氧化,或分子发生蛋白降解,则失去抗凝活性。
若C端羧基被酯化,或失去C端氨基酸,也会失去与凝血酶结合能力。
水蛭素干燥状态下稳定,室温下水中可稳定存在6个月,80℃下加热15min不被破坏。
pH值升高则稳定性下降,在0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液中可稳定15min。
水蛭素不被胰蛋白酶水解,对α-糜蛋白酶也有一定耐受性,但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。
由于天然水蛭素来源非常困难,每条水蛭只含20μg水蛭素,不能满足临床应用。
为此,国外多家公司及研究单位从80年代末就开始研究采用基因工程技术生产重组水蛭素。
当前,在国外已上市水蛭素产品有Hoechs公司重组水蛭素(Lepirudin,商品名Refludon),Novartis公司重组水蛭素产品(Desirudin)。
1997年,本院合成了重组水蛭素Ⅲ基因并构建了大肠杆菌外分泌表达体系,分泌型重组水蛭素Ⅲ基因工程菌表达产物重组水蛭素Ⅲ(recombinehirudinⅢ,简写为rHV3)相
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- 中国 药科 大学 生物制药 基本 工艺 实验 指导