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以DNA如模板合成RNA的过程,即将遗信息由DNA传给RNA的过程。
4、翻译(translation):
以RNA的模板合成蛋白质的过程,即将遗传信息由RNA传给蛋白质的过程。
5、基因表达(geneexpression):
指遗传信息由DNA经RNA最终表达为蛋白质的过程。
包括转录、翻译两个步骤。
6、逆转录(Reversetranscription)以RNA为模板合成DNA的过程。
即将遗信息由RNA逆向传给DNA的过程。
其遗传信息传递方向与转录相反。
故名逆转录。
本篇以中心法则为主线索,着重阐述遗传信息传递的基本规律(复制、转录、翻译)。
在此基础上,介绍基因表达的调控和分子生物学的新技术。
DNA的生物合成包括复制和逆转录,复制为大多数生物所共有,而逆转录只存在于个别生物体中,故本章着重讲述与复制相关的内容。
第一节复制的方式——半保留复制
当细胞分裂时,DNA即开始复制,其主要特征为半保留复制(semi-conservativereplication)。
一、半保留复制的定义:
DNA的两条链均可作为模板,合成出子代DNA与母代完全相同,且一条链来自母链,一条链是新合成的,这种复制方式称为Semi-conservativereplication
二、半保留复制的实验依据:
1953年Watson和Cmick在提出双螺旋模型时即已推测出复制方式。
1958年M.Messelson和F.W.Stahl用实验加以证实。
实验方法见P221图11-1
三、半保留复制的意义:
由于DNA分子中两股链有碱基互补关系,一条链即可确定其互补链的碱基序列。
按半保留复制的方式,子代保留了亲代的全部遗传信息,通过基因表达,决定了子代生物的特性和类型。
故半保留复制的意义为:
保持了代与代之间DNA序列的一致性,体现了遗传过程的相对保守性。
第二节参与复制的酶
参与复制大分子物质有:
1、底物(substrate):
dNTP(N:
A、T、C、G)
2、模板(template):
母代DNA的两条单链。
3、引物(primer):
为一有3’—OH的寡核苷酸。
4、酶和蛋白:
包括聚合酶、解链解旋酶、引物酶、连接酶等。
一、DNA聚合酶
全称为DNAdependentDNApolymerese(DDDP),1958年A.Kornberg在大肠杆菌中发现了polⅠ,并在试管内证明了其聚合酶活性.
(一)DDDP催化的反应
较清楚的是原核生物的DDDP。
1、5’—3’聚合活性
以母链为模板,按碱基互补规律,DDDP在引物3’—OH上逐个加上dNTP使新链延长,见P223反应式为(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi
DDDP的聚合方向只能是5’—3’。
2、核酸外切酶(exonucleasae)活性:
表现为3’-5’外切酶和5’-3’外切酶活性。
3’-5’外切酶在复制的校读及损伤修复中起作用,5’-3’外切酶则在引物切除及损伤修复中起作用。
(二)种类
1、原核生物的DNA聚合酶:
E.coli中有PolⅠ、PolⅡ和polⅢ,三者在细胞中的分子数之比为400:
40:
20,但活性polⅢ是PolⅠ的10倍以上,故认为polⅢ是复制中起主要作用的酶。
polⅢ的分子量约140KD,由10种亚基组成不对称的二聚体(图11-5A),有聚合酶和3’-5’外切酶活性,每分钟催化约105个核苷酸聚合。
其中α、ε、θ组成核心酶,α亚基有5’-3’聚合酶活性,ε亚基有3’-5’外切酶活性及碱基选择功能,θ亚基可能起维系二聚体的作用。
两边的β亚基起结合模板的作用。
其余的亚基统称为γ-复合物,具体功能尚在研究中。
PolⅠ的分子量约为109KD,为单一肽链,以α螺旋为主,有A-R共18个α螺旋区(图11-5B),有聚合酶、3’-5’外切酶和5’-3’外切酶活性,每秒钟催化约10个核苷酸聚合。
由于PolⅠ只能催化合成约20个核苷酸,即从模板上脱离,故主要在校读和修复中起作用。
在特异蛋白酶作用下,PolⅠ可被水解为67KD和36KD大小两个片段(图11-5B的F、G螺旋间):
大片段又称Klenow片段,具有聚合酶和3’-5’外切酶活性,小片段具有5’-3’外切酶活性。
这两个片段均为分子生物学研究的工具酶。
PolⅡ只在无polⅢ和PolⅠ存在的情况下才起作用,其真正功能尚未明了。
2、真核生物的DNA聚合酶:
真核生物的DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε五种
polα及δ相互配合参与复制。
以往曾认为polδ催化前导链的合成,polα催化随从链的合成。
现在认为polα与引发酶共同起引发作用,由polδ催化前导链和随从链的合成。
在链的延伸中有PCNA(增殖细胞核抗原,proliferatatingcellnucleusantigen)参与。
polε与原核的polⅠ相似,起校读、修复作用。
polβ则与原核的polⅡ相似。
polγ存在于线粒体内参与线粒体DNA(mitochondiaDNA,mtDNA)的复制。
MtDNA已知有37个基因,13为编码蛋白质或酶的基因,其余只转录RNA(22条转录tRNA,2条转录rRNA)。
由于缺乏蛋白质的保护及相应的损伤修复系统,mtDNA容易发生突变,而损伤后修复较困难。
随年龄的增长,由此引发的疾病(如盲、聋、痴呆、肌无力、糖尿病等)日显突出,已引起医学界的广泛兴趣。
原核及真核生物的DNA聚合酶归纳如下表:
原核生物
种类
功能
5’-3’聚合
5’-3’外切
3’-5’外切
PolⅠ
修复及校读
+
PolⅡ
不清
-
polⅢ
复制
真核生物
polα
引发
polβ
修复(同PolⅡ)
polγ
线粒体DNA复制
polδ
polε
修复(同PolⅠ)
(三)特点:
1、聚合方向:
DDDP只能催化5’—3’的聚合反应。
2、需引物:
DDDP不能催化游离的dNTP从头聚合,只能以寡核苷酸的3’—OH作为合成新DNA链的起点,该寡核苷酸称作引物。
3、高度保真性:
也就是对模板的高度依赖性(即与模板保持高度的一致性),体现在:
1)DDDP能严格遵循碱基互补规律,选择与母链对应的dNTP与之配时,然后催化聚合反应。
2)当复制出错时,DDDP有即时的校读功能(Proofread)
二、解旋解链酶类:
至少有三大类
(一)解链酶(helicase):
又名rep蛋白、DnaB蛋白
1、作用:
解开DNA双链,分开两链间的碱基对。
2、特点:
每解开一对碱基耗2个ATP
3、种类:
有DnaA、DnaB(即解链酶))、DnaC。
DnaA辨认ori,DnaC辅助解链酶(DnaB)在起始点结合并结开双链。
(二)DNA拓扑异构酶(拓扑酶:
topoisomerase):
拓扑是指物体或图象作弹性移位而又保持物体不变的性质。
1、种类及作用形式:
1)拓扑酶Ⅰ只切断DNA双链中的一股,使螺旋松驰不打结,然后再将切口封起。
2)拓扑酶Ⅱ(即旋转酶,gyrase)可切断超螺旋DNA的两股链,切口处的两链旋转,使超螺旋结构松驰,在ATP存在时,DNA分子由松驰——负超螺旋。
最后将断端封好。
2、作用:
理顺DNA的结构,防止其打结、缠绕,配合复制过程。
在DNA复制时,拓扑酶可松弛超螺旋结构,有利于复制叉的行进和DNA的合成;
复制完成后,拓扑酶又可将DNA引入超螺旋结构,以形成染色质。
(三)单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)
1、组成:
SSB由177个氨基酸残基组成的相同四聚体,每个SSB可覆盖DNA单链上32个核苷酸。
1)与单链DNA结合,防止重新形成双螺旋
2)保护单链DNA,免受Dnase作用而降解。
三、引物酶和引发体:
(一)引物酶(primase):
为一特殊的RNApolymerase
1、作用:
在模板复制起始部位,可催化四种NTP聚合成RNA,为DDDP提供3’—OH未端。
2、特点:
只以DNA为模板,聚合方向只能为5’—3’。
(二)引发体(primosome):
为蛋白,酶的复合体
由DnaA、DnaC、解链酶(DnaB)和其它复制因子+引物酶构成引发体。
其作用是解开双链,合成引物。
四、DNA连接酶(DNAligase)
(一)作用:
催化单链缺口3’-OH与5’-P形成磷酸二酯键,将DNA片段连接起来。
(二)特点:
1、消耗ATP
2、只连接双链中的单链切口。
三种酶催化形成磷酸二酯键的比较
DNApolgmerase:
在oligdn或olign引导下,催化dNTP间形成磷酸二脂键,使dNTP聚合成DNA链。
DNA连接酶:
催化DNA两片段间形成磷酸二脂键,修复单链缺口。
Topoisomerase:
先切断DNA螺旋结构,再将断端连成磷酸二脂键,改变拓朴状态。
第三节复制的过程P231
一、复制的特征:
(一)复制的起始点
DNA的复制要从DNA分子的特定部位开始,此部位叫复制的起始点(originofreplication,ori)。
原核生物只有一个特定的起始部位,如E.coli的oriC。
而真核生物则有多个ori,如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点。
两个ori之间的DNA片段称为复制子(replicon)。
复制开始时,复制的起始点呈现的叉形(Y形)结构称为复制叉(replicationfork)。
(二)复制的方向
复制的方向可以有三种不同的方式:
1、单向单链复制:
两个ori,如腺病毒DNA的复制。
2、双向单链复制:
一个ori,形成一个复制叉,如质粒ColEⅠ,后叙的滚环式复制亦属此类。
3、双向双链复制:
一个ori,,形成两个复制叉——双向复制(bidirectionalreplication)。
这种方式最为常见。
(三)复制的半不连续性
作为模板的DNA双链是反向平行的,而DDDP的聚合方向只能是5’—3’,故合成的子代DNA,一条链的延伸方向与复制叉的行进方向一致,可连续合成,称为前导链或领头链(leadingstrand);
而另一条链的延伸方向与复制叉的行进方向相反,只能间断合成,称为随从链(laggingstrand)。
由于领头链的合成是连续的,而随从链的合成是不连续的,故从总体上看DNA的复制是半不连续复制(semidiscontinuousreplication)。
二、复制的过程
主要介绍原核生物的复制过程。
(一
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