基因组学考试重点Word文件下载.docx
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基因组学的研究又在于基因组间的比较。
(10)基因组学的复杂性必然导致多学科的引进和介入(各生物学科、医学、药学、计算机科学、化学、数学、物理学、电子工程学、考古学等)。
(11)基因组学研究的手段和技术已经走在生命科学研究的最前沿。
(12)基因组信息来自于高效率和规模化所产生的实验数据。
(13)人类基因组计划证明了基因组研究的迫切性和可行性。
3、大规模基因组测序的几个支撑技术是什么?
(1)Sanger双脱氧末端终止法
双脱氧终止法,即sanger测序法,是根据DNA在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列DNA片段,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见的DNA碱基序列。
通俗点说,就是通过电泳的方法将一系列DNA片段从小到大排列起来,由于每条片段末尾都含有荧光标记的碱基,通过放射性自显影,即可读出这些碱基的种类,这些碱基的排列顺序,就是待测DNA的序列。
(2)PCR技术
聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方.聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
(3)DNA自动测序仪的发展
DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。
自动化测序实际上已成为当今dna序列分析的主流。
美国peabi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。
本实验介绍的是abiprism310型dna测序仪的测序原理和操作规程。
(4)生物信息学分析软件硬件设备
4、大规模基因组测序的两种策略是什么?
二者有何区别?
(1)逐步克隆法(ClonebyClone)
(2)全基因组霰弹法(WholeGenomeShot-gun)
(3)二者的比较:
项目
策略
全基因组霰弹法
逐步克隆法
遗传背景
不需要
需要(需构建精确的物理图谱)
速度
快
慢
费用
低
高
计算机性能
高(以全基因组为单位进行拼接)
低(以BAC为单位进行拼接)
适用范围
工作框架图
精细图
代表测序物种
果蝇、水稻
人、线虫
5、人类基因组计划所构建的四张图是什么?
(1)遗传图谱:
又称为连锁图谱(linkagemap),指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离。
(2)物理图谱:
以定位的DNA标记序列如STS作为路标,以DNA实际长度即bp、kb、Mb为图距的基因组图谱。
(3)转录图谱:
利用EST(expressedsequencetags表达序列标签)作为标记所构建的分子遗传图谱。
(4)序列图谱:
通过基因组测序得到的,以A、T、G、C为标记单位的基因组DNA序列。
6、STS的定义,原理、要满足的条件及其来源。
(1)序列标记位点(STS)是一段短的DNA序列,通常长度在100到500bp,易于识别,仅存在于待研究的染色体或基因组中。
作一套STS图谱需要收集来自单条染色体或一个完整基因组的重叠的DNA片段。
在图1中,从单条染色体中制备一组DNA片段,使染色体上每一点平均有5条片段对应。
收集作图必需的数据时,须排列每一STS,了解哪些片段包含有哪些STS。
这可以通过杂交分析来完成,但通常使用PCR方法,因为PCR更快捷,更易于自动化,两个STS共存于同—个片段的机率依赖于它们在基因组中的相近程度。
如果它们相当接近、它们存在于同一片段的机会就相当大;
而如果它们位置相对分开,有时它们会在同一片段上,有时则不会(图1)。
因此,这些资料可用来计算两个标记间的距离,其方式与计算连锁分析中计算图距的方式相同;
在连锁分析中,两个标记间的图距是根据它们的交换频率来计算的。
STS作图与其相比、不同之处仅在于两个标记间的图距是根据分离频率来计算的。
(2)这些片段覆盖染色体的全长,染色体上每一点平均有五条片段相对应,染色体图谱上两个接近的标记共同存在于一条片段的可能性就高,相隔较远的标记位于同一条片段中的可能性就较小。
(3)一个DNA序列要成为STS,须满足两个前提。
首先它的序列必须是己知的,以便于用PCR方法检测STS在不同DNA片段中存在与否。
第二个要求是STS必须在待研究的染色体上有唯一的定位,或当DNA片段群覆盖全基因组时,STS在整个基因组中具有唯一的定位位点。
如果STS序列具有多个定位点,那么作图数据将会模糊不清。
因此需要确保STS不包含重复DNA的序列。
(4)上述两个前提易于满足,因此可以通过多种途径获得STS,最常见的来源是:
①表达序列标记:
表达序列际记(expressedscquencetag,E5T)是通过互补DNA(cDNA)克隆分析获得的短序列。
制备互补DNA是将mRNA转化成双链DNA.由于细胞中mRNA来自于编码蛋白的基因,故此cDNA代表了mRNA来源的细胞中表达的基因序列。
EST被看做获得重要基因序列的快捷途径。
即使其序列不完整,也仍然有价值。
如果EST来自于单一序列DNA,不是基因家族中的某一成员,它也可以被用作STS。
而所谓基因家族是指一组具有相同或相近序列的基因。
②遗传标记序列:
如微卫星标记。
③随机基因组序列可以通过对克隆的基因组DNA的随机小片段进行测序或在数据库中搜寻贮存序列获得。
7、逐步克隆法包括哪几个步骤?
(1)物理图谱的构建——序列标签位点作图
①确定各STS序列及其在基因组中的位置;
②大插入片段基因组文库的构建;
(BAC文库的构建P25)
③以特定STS为标记筛选并定位克隆;
④含有STS的克隆在基因组中的排序。
经过这几个步骤,以定位的DNA标记序列(STS)作为路标,以DNA实际长度即bp、kb、Mb为图距的基因组图谱便构建完成了。
此时我们仍然不知道具体的序列信息。
只知道STS的序列和位置,以及STS间的距离。
(2)大片段克隆的筛选(P36;
STS-PCR反应池方案P27)
该步骤包括BAC克隆的筛选和延伸克隆的筛选。
前者可使相互间具有重叠片段的BAC克隆根据STS信息组装成contig,并定位与基因组上。
后者主要是补充基因组中未被BAC文库覆盖的克隆序列,常用方法有指纹图谱法和末端序列步行法。
经过这一步,我们得到了覆盖整个基因组全序列的克隆,以备测序。
(3)霰弹法测序与“工作框架图”的构建
用霰弹法对筛选到的BAC克隆进行测序,得到大量随机片段。
组装这些片段,可能会出现如下问题:
低碱基质量区、单链区、序列缺口、未组装区。
通过重测序等手段对这些区域进行补充,即所说的Finishing,便可得到高质量的全序列。
(4)序列的全组装与“完成图”构建
对测序后的BAC克隆序列进行拼接,完成该基因组的序列图谱。
8、全基因组霰弹法的测序流程?
全基因组霰弹法测序的整个流程如下图所示
(1)从头组装流程:
SolexaPart&
454Part(P31)
(2)ReadsProcess流程:
Solexaand454(P31-32)
(3)Hybridassembly和基于EST的组装
(4)粗测序reads的预处理P32
①意义和目的;
②流程;
③图像分析和碱基读出;
④质量控制
(5)数据评价P33
①Read质量分布;
②文库插入大小;
③MappingRate;
④二聚体评价
(6)用Kmer估计基因组大小
(7)基因组混合拼接验证及结构变异检测流程
(8)重复序列注释流程
(9)基因结构及功能注释技术路线(GeneOntologyandKEGG)
9、Kmer介绍
(1)
定义:
就是一个长度为K的DNA序列,K通常取17。
(2)
用途:
纠正测序错误,估计基因组大小、杂合率、重复序列的含量。
(3)
K-mer分布图,同样数据量的情况下,峰位决定基因组大小,峰位越靠左,基因组越大。
峰值表示大部分K-mer都出现在这个深度。
(4)
峰位高低的影响因素:
a、错误率,错误率越高,起始峰位越高,主峰相对越低;
b、重复序列,重复序列越多,主峰下降越慢。
(5)
杂合率越高,则杂合峰越高,杂合峰出现在主峰的一半处,按照杂合峰大小估计基因组大小,基因组大小等于二倍杂合峰。
(6)
假设一条reads长45bp,K=17,则每个Reads产生的K-mer数=45-17+1
若测序深度为10×
,则K-mer实际覆盖深度=10*(45-17+1)/45
(7)
基因组大小:
若在主峰顶端对应的K-mer次数为15,实际测序量为100G,则基因组大小=100*(45-17+1)/45/15
(8)
不能直接根据杂合峰和主峰的高度估计基因组的杂合率大小,只能通过模拟数据,再用实际数据与模拟数据进行比较,找出最接近的一个,来推测基因组的杂合率大小。
(9)
测序深度越低,杂合峰与主峰越接近y轴,随着测序深度的增加,会将杂合峰和主峰展开,容易看出杂合峰与主峰的关系。
(10)纯下降的K-mer图,原因可以能是数据量不够;
若开始下降后来有峰的K-mer图,前面下降的地方可能是测序错误。
(11)当数据量超过K-mer最高值(255M)时,则无峰。
第二章新一代测序技术
一、第一代测序技术简介
※Sanger测序法(双脱氧核糖核苷酸末端终止法)的原理?
Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,并且在每个碱基后面进行荧光标记,产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得可见的DNA碱基序列。
Sanger法测序的原理就是,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增,并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。
由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地
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