艾德KRAS试剂盒说明书样本Word文档下载推荐.docx
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DeRoock.W.JAMA.;
304(16):
1812-1820)。
因而,KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗针对性,减少治疗费用,节约宝贵治疗时间。
大某些肿瘤突变都是体细胞突变,突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起,因而所提取DNA常带有大量野生型DNA,因此对体细胞突变检测需要较高特异性,而当前广泛使用直接测序法检测能力有限,不能完全满足临床需要。
本试剂盒用于检测人类KRAS基因12和13密码子上7种热点体细胞突变(见表1),试剂盒以DNA为检测样本,提供突变状态定性评估。
辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物大肠癌等癌症患者。
该产品用于组织中提取DNAKRAS基因7种突变检测,为临床医生对大肠癌或肺癌患者选取肿瘤靶向药物治疗提供参照。
表1人类KRAS基因12和13密码子上7种热点体细胞突变突变名称氨基酸变化碱基变化CosmicID公司命名Gly12Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGT>
GAT52112-2-AGly12Ala甘氨酸到丙氨酸GGT>
GCT52212-2-CGly12Val甘氨酸到缬氨酸GGT>
GTT52012-2-TGly12Ser甘氨酸到丝氨酸GGT>
AGT51712-1-AGly12Arg甘氨酸到精氨酸GGT>
CGT51812-1-CGly12Cys甘氨酸到胱氨酸GGT>
TGT51612-1-TGly13Asp
甘氨酸到天门冬氨酸
GGC>
GAC532
13-2-A
【检测原理】
本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术,检测DNA样品中具有突变基因。
运用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大,与此同步,运用双环探针对扩增产物进行检测,结合特别PCR反映程序和高特异Taq酶使用,在实时PCR平台上实现对样品DNA中突变检测,以达到对稀有突变检测高特异性和高敏捷度,即高选取能力。
【重要构成成分】
试剂盒采用8联PCR管设计,每一种8联PCR管检测一种样品,8联管1-7(或A-G,或8联PCR管两端各有一种小孔,小孔居侧端为1号管,小孔居中端为8号管)管内装有相应KRAS基因7种突变检测和内控试剂,突变由FAM信号批示,内控由HEX(或VIC)信号批示;
8(或H)号管作为DNA提取质量外控检测管,亦由FAM信号批示,内控和外控作为对试剂、DNA质量以及操作自身质控,选取检测区域是人类KRAS基因相对保守
区段,约100bp,这样即便DNA有降解,外控和内控依然可以最真实地反检测所用DNA质量非常重要。
由于肿瘤复杂性,所采集临床样品应KRAS基因有效DNA量。
每个PCR反映管内均具有5~10pM特异性引往往会混有正常组织细胞,不同类型样品正常细胞混杂限度不同,并且提取物、20pM双环探针、12.5μMdNTPs、175μM氯化镁、1mM硫酸铵、2.5mMDNA纯度和质量也因样品类型而变化,特别是用福尔马林固定石蜡切片样氯化钾和纯化水等。
(详见表2和表3)
品,福尔马林会对DNA有交联和降解作用,因而请按下面推荐样品类型顺序表2试剂盒构成
收集样品并提取DNA用于检测,客户可依照临床实际样品状况进行选取。
试剂盒规格12测试1.推荐样品类型顺序:
新鲜病变组织>
冰冻病理切片>
石蜡包埋病理组织或切8联PCR管反映条12条片。
Taq酶(KRAS)35μL2.推荐使用商业化试剂盒来提取人类基因组DNA。
所提DNA需用紫外分光KRAS阳性质控品
250μL
光度计测定浓度,其DNAOD260/OD280在1.8~2.0。
提取完DNA建议立表38联PCR管反映条构成
即进行检测,否则请于-20℃如下保存,保存时间不要超过6个月。
管号检测试剂体积荧光信号3.从新鲜病变组织中取样应拟定至少具有30%肿瘤病变组织。
1A12-2-A35μLFAM,HEX/VIC2B12-2-C35μLFAM,HEX/VIC4.石蜡包埋病理组织或切片样品应拟定具有肿瘤病变细胞,所取某些尽量在3C12-2-T35μLFAM,HEX/VIC蜡块中部。
4或D12-1-A35μLFAM,HEX/VIC5.所用石蜡包埋病理组织或切片样品普通请选取保存尚未超过3年样品。
5E12-1-C35μLFAM,HEX/VIC【检查办法】
6F12-1-T35μLFAM,HEX/VIC建议在每次PCR反映中,每份样品和阳性质控品(STD)、阴性对照(NTC,7G13-2-A35μLFAM,HEX/VIC
自备纯化水)共同进行分析。
8H
外控
35μL
FAM1.取出KRAS阳性质控品和Taq酶(KRAS),阳性质控品先解冻,再振荡混匀。
其他需要自备试剂和耗材有:
阳性质控品和Taq酶(KRAS)需迅速离心15秒待用。
1.石蜡切片样品DNA提取试剂推荐选用厦门艾德生物公司核酸提取试剂2.分别向体积均为45μL待测样品DNA、KRAS阳性质控品和纯化水(NTC)(型号:
FFPEDNA,CatNO.ADx-FF01);
组织和胸水可使用厦门艾德中加入2.25μLTaq酶(KRAS),涡旋器上混匀15秒,然后迅速离心15秒。
生物公司组织、胸水样品DNA分离试剂盒(CatNO.ADx-TI01)。
(1)依照样品来源不同,可将其分为石蜡切片样品和非石蜡切片样品。
2.无DNase和RNase移液器滤芯吸嘴。
新鲜病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。
3.无DNase和RNase纯化水。
(2)石蜡切片样品DNA浓度推荐为1.5~3ng/μL,即每单个反映管添加
【储存条件及有效期】
DNA量为7.5~15ng。
依照石蜡切片样品保存年限不同,建议:
须避光储藏在-20±
5℃。
有效期为10个月。
开瓶后使用不影响产品有效保存不超过三个月石蜡切片样品每单个反映管添加DNA浓度期。
使用完毕后于-20±
5℃保存。
为1.5ng/μL;
保存年限三个月至一年石蜡切片样品每单个反映管试剂盒在运送过程中,需要泡沫箱加冰袋密封运送,运送时间不超过一周,添加DNA浓度为2ng/μL;
保存年限一年至三年石蜡切片样品每运送温度不高于室温。
单个反映管添加DNA浓度为2.5~3ng/μL;
不推荐使用保存超过三【合用仪器】
年石蜡切片样品。
StratageneMx3000P?
/3005P?
、ABI7900HT、ABI7500、ABIStepOnePlus、(3)非石蜡切片样品DNA浓度推荐为0.4~1ng/μL,即每单个反映管添
ABI7300、LightCycler480、Bio-RadCFX96。
加DNA量为2~5ng。
注意:
(4)稀释样品DNA时推荐使用TE(pH8.0)。
稀释办法不推荐跨数量级
①使用ABI仪器时探针模式设立,ReporterDye:
FAM、VIC;
Quencher稀释,即每次稀释倍数控制在10倍以内;
稀释时取样量体积不适当小Dye:
TAMRA;
PassiveReference:
NONE。
于5μL,以免稀释后终浓度与预算值有偏差。
②在ABI7900中,本试剂盒仅合用于ABI7900普通机型(非FAST机型),3.在PCR管冰架上,轻轻揭开8联PCR管反映条条盖。
如发现管盖内侧有液反映程序模式为原则模式,反映体积选取40μL,且需要PCR8联反映条辅助点,开盖前请先离心。
器(BIOplastics公司,Cat:
7900RAN)。
4.将混好DNA样品依次取5μL靠着PCR管上管壁加入8联PCR反映条中,然③合用于LightCycler480Ⅱ代仪器,若需在LightCycler480Ⅰ代仪器上使后小心盖上8联PCR管反映条管盖。
用,则必要进行荧光校正。
若LightCycler480Ⅱ代仪器也浮现荧光交叉现象,注意:
加好样品PCR反映条应及时上机实验;
若因特殊因素不能及时上则也需要进行荧光校正,且需要PCR8联反映条辅助器(BIOplastics公司,机反映,应将PCR反映条置于冰水混合物上或4℃冰箱(温度恒定)保存,Cat:
B-79480)。
保存时间不适当超过12个小时。
④在使用StratageneMx3000P?
仪器时若发现荧光净升信号5.离心8联PCR管反映条。
(dR)较低且本底荧光(R)非常高,应恰当减少仪器增益设立。
6.将8联PCR管反映条放入实时PCR仪器。
PCR反映板布局见表4中推荐办法。
⑤关于各仪器详细设立办法可从厦门艾德生物医药科技股份有限公司网站资料下载区获得。
⑥PCR仪器在使用过程中应至少每年校准一次。
【样本规定】
1/2
表4PCR仪96孔板建议布局
名称12?
10111212-2-A样品1样品2?
样品10STDNTC12-2-C样品1样品2?
样品10STDNTC12-2-T样品1样品2?
样品10STDNTC12-1-A样品1样品2?
样品10STDNTC12-1-C样品1样品2?
样品10STDNTC12-1-T样品1样品2?
样品10STDNTC13-2-A样品1样品2?
样品10STDNTC外控样品1样品2?
样品10STDNTC7.打开仪器窗口,按照下图中阐明扩增程序图进行设立。
第一阶段:
95℃5分钟,1个循环;
第二阶段:
95℃25秒,64℃20秒,72℃20秒,15个循环;
第三阶段:
93℃25秒,60℃35秒,72℃20秒,31个循环;
信号收集:
第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号,执行实时PCR,保存文献。
8.实验结束后,使用2层PE手套包扎好PCR反映条(使用Mx3000P仪器时应当待热盖冷却后再解决,以免烫伤,同步可避免由于PCR管盖较热易开导致污染),并按生物垃圾解决。
如非特殊需要,禁止打开PCR管盖,以防导致污染。
1.阴性对照(NTC)1-7(或A-G)号管FAM信号应无曲线升起。
若7管其中任一管FAM信号升起,则本次实验成果无效,同步建议重做一次。
若1-7(或A-G)号管HEX(或VIC)信号及8(或H)号管FAM信号偶尔升起,此属正常现象,不影响对突变检测成果判断。
2.阳性质控品(STD)Ct值普通不大于20,但也许会由于不同仪器不同阈值设立而发生波动。
3.拟定实验与否成功可信:
(1)外控对照反映孔FAM信号应当升起。
若为石蜡切片样品,则其Ct值应在15~21之间;
若为非石蜡切片样品,其Ct值应在13~19之间。
(2)若能满足1)规定,则继续进行分析。
(3)如果其Ct值不大于
(1)规定范畴,阐明加入DNA过量,应减少DNA加入量再进行实验。
但突变信号无升起或者落在阴性区,该实验成
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