引物设计流程PPT文件格式下载.ppt
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表现为扩增出目的条带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很弱等。
引物可以通过参考文献获得,也可以进行自己设计,无论哪种方式引物都是要通过计算机软件进行检验。
引物的设计原则可以根据实际需求自己灵活把握。
二、引物设计原则,三、常用的引物设计软件,PrimerPremier5(自动搜索)*Oligo6(引物评价)*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3(在线服务),四、PrimerPremier5和Oligo6介绍,PrimerPremier5主要功能:
1、引物自动搜索和设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析Oligo6主要功能:
引物设计与分析,PrimerPremier5在引物搜索上较Oligo6有优势,并可以对引物序列进行综合评分。
Oligo6在引物结构分析上有比PrimerPremier5强大的功能。
所以,设计引物的时候我们可以将两个软件结合起来。
PrimerPremier5和Oligo6比较,软件使用前的准备工作,1、下载并安装PrimerPremier5和Oligo6。
2.进入NCBI的基因库查找所需的基因序列。
序列的查找方法,CDS是编码序列,所以一般选择此序列作为设计的基因源序列,给出的基因序列为全序列,设计引物只要CDS中的序列,PrimerPremier5引物搜索,PreimerPremier启动界面,选择序列,基本信息,序列名称,源序列,只能用ctrl+v才能输入目的序列,输入序列,引物设计界面,上游和下游链,引物信息栏,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物分值100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer,保存引物信息,保存时要安装一个虚拟打印机,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构,因此最好的情况是最下面的分析栏都没有出现红色,而且评分较高,Tm值55-60之间。
但是往往有时候达不到那么严格的要求,因此我们可以适当放宽要求,但是二聚体和发夹结构是不能有的,Tm值也不能相差超过2。
Oligo6引物结构分析,打开新序列,ctrl+v输入序列,3个弹出窗口,Meltingtemperature,GInternalStability,Frq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。
该频率高则可增加错误引发的可能性。
用Oligo人工设计引物时的3个特点,Tm值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。
Frq曲线宜选用3端Frq值相对较低的片段。
G值在5端和中间值比较高,而在3端相对低,输入引物,选中引物,上游引物,下游引物,引物结构分析,引物关键信息,发夹结构,引物二聚体,GC含量,PCR总信息,错配信息,引物筛结构分析条件1.KeyInformation:
3,端得G9kcal/mol。
Tm尽量一致,最好控制在5560。
2.DuplexFormation:
3base,G4.5kcal/mol。
3.HairpinFormation:
4.GC%:
GC含量在4060%之间,两条引物最好保持一致。
5.Falseprimingsites:
要使错误引发效率在100以下,当然有时候正确位点的引发效率很高的话,比如达到400500,错误引发效率超过100幅度若不大的话,也可以接受。
最终PCR信息,五、引物BLAST,判断一个引物是否合适最重要的一步就是比对,如果你所设计的的引物通过比对不能返回到你设计引物的源基因,那么你的引物就是不合格的,即使你设计出来的引物其余的条件都符合,必须放弃。
1.进入BLAST界面,2、输入引物对,引物对要从5,端到3,端输入,上游引物和下游间输入20以上n,比对条件设置,3、比对结果,图中代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分图中代表这些序列与引物匹配的得分值位于4050分图中代表这些序列与引物匹配的得分值位于80120分,分值越高,特异性越好。
线段代表上或下游引物,其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。
图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配(Strand=Plus/Plus)、并与下游引物互补(Strand=Plus/Minus),理论上可以扩增出基因片断。
没有连线的,表示单条引物与该基因一致。
谢谢!
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