葛根对成骨细胞OPGRANKLmRNA表达的阻碍Word文件下载.docx
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对照组灌服生理盐水,中药组灌服2g/ml的葛根10ml/kg·
d,1日2次灌胃,持续3天,最后一次灌胃后中药组和对照组别离1h、2h、4h无菌操作股动脉采血,搜集血清备用。
诞生24h内的SD大鼠,无菌取颅盖骨,做成骨细胞培育。
第三代成骨细胞5×
104/ml细胞悬液,24h待细胞贴壁后加入实验因素,6天后用异硫氰酸胍一步法提取总RAN,然后用RT-PCR检测OPG、RANKLmRNA的表达。
结果最后一次用药后2h采血的中药血清可明显上调成骨细胞OPGmRNA表达,且明显下调成骨细胞RANKLmRNA的表达。
随血清添加量的增加,对成骨细胞OPGmRNA表达上调作用越强,对成骨细胞RANKLmRNA的表达无阻碍。
结论实验说明,葛根可能通过上调成骨细胞OPGmRNA的表达,下调成骨细胞RANKLmRNA的表达,抑制破骨细胞的产生和功能,为葛根防治骨质疏松提供了有力的实验依据。
【关键词】葛根;
成骨细胞;
OPG;
RANKL
【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectsofrootsofkudzuvineonthemRNAexpressionofOPGandRANKLofosteoblastsusingRT-PCR.ToprovidetheexperimentalbaseforitspreventingandtreatingtheOPinclinic,itisurgenttoexplorethemechanismofrootsofkudzuvineanti-osteoporosisincellandmolecular36SDratsweighting(250±
10)g,arerandomlydividedintotwogroups.Controlgroupandherbgroupwereadministeredorallywithphysiologicalsaltsolutionandwithepimediumsagittatummaxim(2g/ml)twiceadayat10ml/kgbodyweightperday,respectivelyforthreedays.Atthethirddaytheserumwascollectedfromthefemoralarteryatonehour,twohoursandfourhoursafterthelastadministrationofmedicine.Primaryratosteoblastswereisolatedfromnewbornmousecalvariae.Thethirdpassageosteoblastswereplatedatthedensityof5×
104/mlin75mlcultureflask,twentyfourhourslatertreatmentfactorswereadded.TotalRANwasextractedfromosteoblastsusingguanidine,andmRNAexpressionofOPGandRANKLwereexaminedusingSerumofrootsofkudzuvinecanup-regulatemRNAexpressionofOPGofosteoblastsanddown-regulatemRNAexpressionofRANKLofeffectofserumofmedicineharvestedat2hafterthelastmedicineadministrationisthemoststrongandtheeffectforOPGwasindose-dependentmanner,howevertheeffectforRANKLwasnotindose-dependentTheexperimentshowesrootsofkudzuvinemightinhibitthegenerateandfunctionofosteoclastbyup-regulatingthemRNAexpressionofOPGanddown-regulatingmRNAexpressionofRANKL.IthasprovidedtheexperimentbaseforrootsofkudzuvinepreventingandtreatingtheOPinclinic.
【Keywords】rootsofkudzuvine;
osteoblast;
随着老龄化社会的到来,骨质疏松症已成为世界普遍的问题之一。
许多激素及细胞因子通过调剂破骨细胞和成骨细胞这两类细胞的数量和活性,使骨量维持动态平稳。
成骨细胞骨形成功能的消退和/或破骨细胞骨吸收作用的增强可造成代谢性骨病,如骨质疏松。
最近几年来发觉的护骨素[1,2](osteoprotegerin,OPG)、核因子-κB受体活化子配体[3,4](receptoractivatorofNF-KappaBligand,RANKL)及其相关因子核因子-κB受体活化子[5](receptoractivatorofNF-KappaB,RANK)对骨质疏松的发病机制和防治有了新的熟悉,而且成为骨代谢研究的新的靶点。
OPG作为RANKL的诱骗受体阻断其与表达于破骨细胞前体细胞和成熟的破骨细胞表面的功能性受体RANK的作用,从而抑制破骨细胞的分化和功能。
OPG和RANKL基因在成骨细胞都可表达,由成骨细胞分泌的OPG及RANKL在破骨细胞分化、成熟和信号传递进程中起着重要的调剂作用。
现代医学证明葛根(rootsofkudzuvine)要紧的有效成份为异黄酮类,其有雌激素样作用,属于天然的植物雌激素(phytoestrogen,PE)。
本研究用RT-PCR的方式观看含葛根中药血清对成骨细胞细胞因子:
OPG、RANKLmRNA表达的阻碍,力求从细胞水平和分子水平对葛根抗骨质疏松的机制进行探讨,为葛根应用于临床防治骨质疏松提供有力的实验依据。
1材料与方式
实验动物诞生24h内的SD大鼠,(250±
10)gSD大鼠,由河北医科大学实验动物中心提供。
药物与试剂葛根(购于保定市第三中心医院),DMEM培育基(GiBco),胰蛋白酶(GiBco),Ⅱ型胶原酶(Sigma),新生小牛血清(NCF)(北京鼎国生物试剂公司),RT-PCR试剂(北京赛百盛基因技术公司),PCR引物:
OPG(genebank:
NM-012870)北京赛百盛基因技术公司合成,上游引物:
5′-CGAGTGATGAATGCGTGTA-3′下游引物:
5′-TTCTGAAGTAGCAGGAGGC-3′扩增产物为301bp;
OPGL(genebank:
NM-057149)北京赛百盛基因技术公司合成,上游引物:
5′-CCATCGGGTTCCCATAAAG-3′下游引物:
5′-TGAAGCAAATGTTGGCGTA-3′扩增产物为142bp;
β-actin(genebank:
NM-031144)上海捷倍斯公司合成,上游引物:
5′-GAGACCTTCAAGACCCCAGCC-3′下游引物:
5′-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′扩增产物为404bp。
要紧器械与仪器CO2培育箱(德国Heraus),倒置显微镜(重庆光学仪器厂),PCR扩增仪(美国MJResearch公司产品)。
方式
成骨细胞培育诞生24h内的SD大鼠,75%乙醇浸泡5min,无菌取颅盖骨,在D-Hanks液中认真刮去结缔组织,清洗3次后将剪碎的骨片于%胰蛋白酶室温消化15min,%Ⅱ胶原酶室温消化45min,移入DMEM(含20%小牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素)培育基,37℃5%CO2培育箱中培育,3天后换培育基,待细胞80%汇合后用%胰蛋白酶消化,以含10%NCF的DMEM培育基吹打,制成细胞悬液,计数后传代。
动物分组及给药中药葛根常规煎熬,加热浓缩终浓度为2g/ml。
SD大鼠32只,雌雄兼用,随机分为2组:
中药组,生理盐水组(对照组),20g/kg·
d1日2次灌胃,持续3天。
含药血清制备最后一次灌胃后别离1h、2h、3h无菌操作股动脉采血,将大鼠血离心3000r/min取血清,每组血清混匀,于56℃水浴30min灭活,-20℃保留,历时μm微孔滤膜过滤,用无血清DMEM配成所需浓度。
成骨细胞OPG及RANKLmRNA表达的检测
成骨细胞中总RNA的提取成骨细胞传至第三代,将细胞用%胰蛋白消化,细胞计数后用含10%小牛血清的DMEM培育基制成5×
104/ml细胞悬液,接种于75ml培育瓶,37℃5%CO2培育箱中培育,24h待细胞贴壁后加入不同时效和量效的中药血清和对照组血清,每组重复4瓶,培育6天后采纳异硫氰酸胍一步法提取总RAN,-70℃保留。
RNA鉴定和定量取5μlRNA溶液经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度和完整性,紫外灯下观看;
另取5μlRNA溶液稀释后于260nm、280nm测定光密度,计算RNA含量及OD260nm/OD280nm比值以确信其纯度。
选OD260nm/OD280nm比值在~间的RNA作RT-PCR。
RT-PCR
cDNA合成取模板RNAμg和下游引物15pmol,混匀,70℃孵育5min,放入冰浴中,在反映体系中加入孵育的混合物和上游引物15pmol,补无菌三蒸水至20μl,混匀后短暂离心。
放入PCR仪中,42℃60min,94℃5min。
PCR94℃变性40s,50℃退火40s,72℃延伸1min,循环30次,72℃延伸5min。
PCR产物分析PCR产物5μl上样于%琼脂糖凝胶中电泳,电压为3~5V/cm,电泳缓冲液为×
TBE,30min后停止电泳。
紫外灯下观看并用数码相机照相,图像用AdobePhotoshop软件去色,转换为TIF格式后用Tatallab软件分析,取得待测的RNA扩增产物与内参照β-actinRNA扩增产物的光密度值,计算每一样品和其内参照的比值:
Asample/Aβ-actin以此作为目的基因RNA的相对表达量。
数据处置数据采纳SAS软件处置,均以x±
s表示,两样本均数比较应用方差齐性查验、t查验和t′查验,组间比较用方差分析查验。
2结果
不同时刻中药血清对成骨细胞OPG、RANKLmRNA表达情形的阻碍见表一、表2。
表1不同时刻中药血清对成骨细胞OPGmRNA表达情形的阻碍
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- 关 键 词:
- 葛根 细胞 OPGRANKLmRNA 表达 阻碍