山药多酚氧化酶的提取和酶学性质研究毕业作品Word格式文档下载.docx
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本实验以新鲜山药为试验材料,采用丙酮粉沉淀抽滤法从新鲜山药中提取多酚氧化酶,提取的粗酶液经20%~50%硫酸铵分级沉淀,透析除盐,得到一种活性较高的多酚氧化酶,测其蛋白含量,并对酶学性质进行研究。
用邻苯二酚为底物,在420nm波长下,采用分光光度法测定山药多酚氧化酶的活力。
研究了pH、温度、底物浓度和抑制剂等不同因素对山药多酚氧化酶活力的影响。
结果表明,山药提取液中蛋白含量为0.1038mg/mL;
山药多酚氧化酶的最适pH为5.6;
最适温度为35℃;
由Lineweaver-Burk方程得到动力学参数:
Km为53.76mol/L,Vmax为0.3924U,山药多酚氧化酶热稳定性实验显示,在50-100℃的温度下水浴处理1h,酶活力均有所丧失,当温度达到85℃时,山药多酚氧化酶彻底失活;
随酶液浓度的变大而成直线上升趋势;
L半胱氨酸、柠檬酸、维生素C及NaCl四种抑制剂都能达到不同程度的抑制效果。
关键词:
山药;
多酚氧化酶;
褐变;
酶活力;
抑制剂
ABSTRACT
Polyphenoloxidase(polyphenoloxidase,EC.1.10.3.1)isaverywidelydistributedtissueinnature,generallyfoundinplants,fungi,insect,polyphenolcompoundscatalyzedbyoxidizedintoQuinones.ThisexperimentwithfreshYamforthetestmaterial,usingacetonepowderbyprecipitationfilterextractionofpolyphenolsfromfreshYamactivity,extractionofcrudeenzymesolutionofammonium20%~50%fractionalprecipitation,dialysisanddesalting,getahighactivityofpolyphenoloxidase,itsproteincontentmeasurementandstudyonenzymaticproperties.Catecholassubstrate,420nmwavelengths,usingtheSpectrophotometricmethoddeterminationofpolyphenoloxidaseactivityinYam.StudyonpH,temperature,concentrationofsubstrateandinhibitoreffectofdifferentfactorsontheactivityofpolyphenoloxidaseinChineseYam.ResultsshowthattheproteincontentintheextractofChineseYam0.1038mg/mL;
YamandpolyphenoloxidaseenzymeoptimumpHof5.6,optimumtemperatureof35℃;
Lineweaver-Burkequationsshoweddynamicparameters:
Kmof53.76mol/L,Vmaxof0.3924U.Yamandthermalstabilityofpolyphenolsoxidaseshow,atatemperatureof50-100℃,inthewaterbathprocess1h,Enzymesarelost,whenthetemperaturereached85℃,Yamandcompletedeactivationofpolyphenoloxidase;
withthechangeofenzymeconcentrationandalignmentontherise;
usedL-cysteineandcitricacid,vitamincandfourkindsofinhibitorsofNaCltoachievevaryingdegreesofinhibition.
Keywords:
Dioscoreaopposita;
polyphenoloxidase;
browning;
activity;
inhibitors
1前言
多酚氧化酶(EC.1.10.3.1)(polyphenoloxidase,PPO)是一种结构复杂的多亚基含铜氧化还原酶,属六大类酶中的第一大类氧化还原酶[1]。
它早在1895年就被发现,直至1937年才被分离得到。
多酚氧化酶具有操作条件温和,反应专一性好等优点[2]。
其特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌[3]。
在广义上,多酚氧化酶可分为三大类:
单酚单氧化酶(酪氨酸酶,tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶,catecholoxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶[4](laccase,EC.1.10.3.1)。
在这三大类多酚氧化酶中,儿茶酚酶主要分布在植物中,微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。
现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
多酚氧化酶来源广泛,在自然界中其分布极广,普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性[4]。
多酚氧化酶由于其检测方便,是被最早研究的几类酶之一[5]。
但是,也有研究表明,不同生物中的多酚氧化酶氨基酸数目差异很大,不同来源的多酚氧化酶的酶学性质和功能也存在差异,存在着大量结构不同的多酚类物质,虽然它们在生物体内具有相似的生理功能,但它们的理化性质却有不同程度的差异性[6]。
在高等植物中,多酚氧化酶是由核编码的含铜的金属蛋白酶,定位于质体内囊体,天然状态无活性,但将组织匀浆或损伤后PPO被活化,从而表现出活性。
当多酚氧化酶与底物接触相互作用,氧化底物产生活性的醌,醌自聚发生合并和细胞内的蛋白质氨基酸基团反应,产生黑色和褐色物质,这也是组织中酶促褐变的主要原因[7]。
因此,多酚氧化酶是生物体内黑色素合成的关键酶,与人的衰老,昆虫的伤口愈合与发育,果蔬的褐变有密切关系[4,8]。
然而山药在加工和贮藏过程中很容易发生褐变,引起色泽、风味和质地的变化,从而影响山药的商业价值。
酶促褐变是果蔬加工过程中普遍存在的现象,尤其是发生在肉质颜色较浅的水果、蔬菜上。
当果蔬受到机械损伤或处于不良环境,如受冻、受热时,尤其在加工过程中,果蔬内的多酚类物质在多酚氧化酶的催化作用下氧化而呈现褐色。
褐变影响果品的营养与外观品质,从而降低产品的商品品质与市场售价。
山药PPO位于其正常细胞的质体中,山药受到损伤后,PPO释放出来。
在有氧环境中,催化酚类物质为邻醌,然后邻醌继续相互作用生成高分子聚合物或与氨基酸或与蛋白质生成高分子络合物,导致褐色素的生成。
目前生产上普遍采用熏硫法来抑制山药褐变,但同时带来了硫超标的问题。
近年来,随着生物技术日新月异的发展,酶工程在各个领域的应用起着越来越重要的作用[1]。
多酚氧化酶的研究也一直受到国内外的关注,其研究涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域,具有多种生理功能,如采用酶工程技术应用于医药产品的制备,污染物的检测,精细化工产品的生产,免疫抗病性,降解木质素,调控IAA、叶绿体的能量转移等[2]。
同时具有较高的经济价值,与食品工业、三废处理、医药卫生关系较为密切,如用多酚氧化酶增强植物和固定化酶制品检测环境中多酚类物质,处理工业“三废”、化学农药降解产生的酚和芳胺等,具有较大的开发价值[9]。
目前,多酚氧化酶在生化、生物学性质方面的研究已取得了较大进展,人们一直在研究多酚氧化酶活性的抑制剂和激活剂,以多酚氧化酶作为研究对象寻找更好的美白剂。
有研究表明,其抑制剂熊果甙和曲酸可被作为化妆品中的增白剂,为色素沉着、黑色素瘤以及白癜风等色素疾病的预防和治疗寻找新的手段[10]。
现在多酚氧化酶的研究主要集中在酶的分离纯化、催化机制、活性调控以及多酚氧化酶基因及其在生物体内的生理作用等方面,虽然人们已经从微生物、植物及多种动物中提取并纯化了多酚氧化酶,但在结构方面,其三维结构仍未得到,同时不同生物体中提取的多酚氧化酶种类也不同,同工酶的存在为多酚氧化酶的研究增加了难度[6]。
因此,此项研究还需要人们不断寻找不同来源的多酚氧化酶,并对其酶学性质和功能进行研究。
本实验针对山药易褐变,难保存,主要是探索酶的基本性质和为防止褐变进行基础研究。
对多酚氧化酶特性进一步加以认识研究,探讨山药中多酚氧化酶的活力、最适pH、最适温度、多酚氧化酶的热稳定性以及不同抑制剂对多酚氧化酶活性的影响等,从而为进一步研制出新型药物和化妆品等提供理论依据。
2材料与方法
2.1材料与试剂
山药(市售);
牛血清白蛋白(BR);
丙酮、柠檬酸、磷酸氢二钠、乙醇、抗坏血酸、(NH4)2SO4、磷酸、氯化钠、L半胱氨酸、邻苯二酚,均为分析纯化学试剂。
2.2仪器
本研究所采用的主要仪器和设备如表1所示。
表1主要仪器和设备
名称
型号
制造商或产地
高速组织捣碎机
DS-1
上海标本模型厂
高速冷冻离心机
GL-25M
上海卢湘仪器离心机仪器有限公司
紫外可见分光光度计
UV-1800
日本岛津公司
精密电子天平
BSA224S-CW
Sartorius科学仪器有限公司
层析实验冷冻柜
YC-1
北京德天佑科技发展有限公司
三孔电热恒温箱
DK-8D
上海齐欣科学仪器有限公司
磁力加热搅拌器
79-1
国华科学仪器有限公司
pH计
PB-10
2.3山药多酚氧化酶的提取
2.3.1丙酮粉的制备
称取50g已去皮的新鲜山药,迅速用不锈钢刀切片,然后加入200mL丙酮(-20℃预冷),用高速组织捣碎机搅拌,混匀后抽滤,取滤饼真空干燥后得丙酮粉,置(-20℃)下备用。
2.3.2山药多酚氧化酶粗酶液的制备
称取1g丙酮粉,加入50mLMcllvaine缓冲液(0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸,pH5.6),用搅拌机高速搅拌15min,4000r/min离心20min,上清液即PPO粗酶液。
2.3.3硫酸铵分级沉淀
(1)取粗酶液6份,每份10mL分别缓慢加入固体硫酸铵粉末至终浓度为10%-60%,进行(NH4)2SO4沉淀1h,4℃,用6000rpm,4℃的低温离心机离心10min。
沉淀用10mLMcllvaine缓冲液溶解。
分别测上清液和沉淀溶解液酶活。
(2)盐析:
将粗酶液用20%的硫酸铵溶液盐析4℃静置2h,6000rpm离心10min,4℃,去除沉淀,保留上清液。
然后将上清液加入硫酸铵进行50%的硫酸铵溶液盐析,4℃静置2h,6000rpm离心10min,4℃,去除
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