精品混饲恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响Word文件下载.docx
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肝微粒体;
苯胺羟化酶
恩诺沙星(C19H22FN3O3)又名乙基环丙沙星,是第一个动物专用的氟喹诺酮类抗菌药物,1987年由德国拜耳公司首创投放市场,我国在1992年由广东海康兽药厂研制成功,其具有杀菌活性强、抗菌谱广、生物利用度高、毒副作用小等优点[1]。
研究恩诺沙星的稳定性,对于保证药物的安全有效、提高药剂疗效、减少给药次数、延长贮存期以及实际生产和药剂用量有重要作用[2]。
陆英杰等研究出恩诺沙星在短期内对实验小鼠免疫细胞有影响,尤其是T淋巴细胞[3]。
孙素玲、程玲玲等研究钼酸胺口服剂量在8.325mg/kg~66.6mg/kg范围内能使大鼠苯胺羟化酶的活力增强[4]。
曾五和(2002)等[5]、罗雅劲(2010)等[6]对恩诺沙星不同剂型在猪体内的药动学及生物利用度进行研究,结果显示,恩诺沙星剂型不同,在体内吸收、达峰时间及消除半衰期时间存在差异。
余建娣等按磺胺间甲氧嘧啶-恩诺沙星2ml(含磺胺间甲氧嘧啶0.1g,恩诺沙星0.05g)试验剂量对20只大白鼠进行腹腔注射,常规饲养8d未见任何动物死亡,故大白鼠对磺胺间甲氧嘧啶-恩诺沙星的最大耐受剂量(MTD)>
0.5g/kgBW(以磺胺间甲氧嘧啶计)。
即MTD大于规定使用剂量25倍以上,休药期应考虑在28d以上[7]。
关于恩诺沙星的研究目前国内只限于对微生态方法,关于恩诺沙星对机体的毒性作用,肝脏苯胺羟化酶活性的影响报道甚少,为此本试验通过对实验小鼠肝脏苯胺羟化酶活性影响的动态观察,为评价不同剂量的恩诺沙星对人和动物生物酶活性的影响,钒的安全评价等提供参考。
1材料
1.1动物的选择和处理
小白鼠40只,体重20—23g,安徽科技学院实验动物中心提供。
观察饲养两周。
1.2主要试剂
恩诺沙星:
分析纯,合肥工业大学试剂厂,批号为030516;
0.9%氯化钠溶液:
安徽环球药业股份有限公司,批号为041025—2;
蔗糖:
分析纯,中国医药集团上海化学试剂公司,批号为H20041215;
三羟甲基氨基甲烷:
分析纯,北京化学试剂公司,批号为031009;
氯化钾:
化学纯,中国上海试剂一厂,批号为04—06—57;
氯化钙:
分析纯AR,国药集团化学试剂有限公司,批号为F20040628;
氯化氢溶液:
分析纯,上海东懿化学试剂公司,批号为20030910;
过氧化羟基异丙苯:
化学纯CP,中国医药集团上海化学试剂公司,批号为T20040110;
盐酸苯胺:
分析纯AR,中国医药集团上海化学试剂公司,批号为W20031020;
三氯乙酸:
分析纯,上海化学试剂采购供应站经销,批号为030114;
无水碳酸钠:
化学纯,山东博山试剂厂,批号为030508;
氢氧化钠:
分析纯,宜兴市第二化学试剂厂,批号为030401;
苯酚溶液:
分析纯AR,上海兴达试剂厂出品,批号为040301;
对-氨基酚:
化学纯CP,国药集团化学试剂有限公司,批号为F20040816;
硫酸铜:
化学纯,合肥工业大学化工厂,批号为040214。
1.3主要仪器
FA1004N型电子天平,上海精密科学仪器有限公司;
YP600型电子天平,上海精密科学仪器有限公司;
TDL80—2B型低速台式离心机,上海安亭科学仪器厂制造;
TGL—16C型高速台式离心机,上海安亭科学仪器厂制造;
DY89—I型电动玻璃匀浆机,宁波新芝科器研究所;
THZ—C恒温震荡器,太仓市光明分析仪器厂;
HH—S恒温水浴锅,江苏国胜实验仪器厂;
BCD—502F型冰箱,青岛海尔冰箱股份有限公司;
721型分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;
1.4药液的配制
蔗糖—Tris—Hcl缓冲液(PH7.4)称取蔗糖85.6g,三羟甲基氨基甲烷1.2g,溶解于约800ml蒸馏水中,用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至1000ml,放置于冰箱中保存备用。
Kcl-Tris-Hcl缓冲液(PH7.4)称取氯化钾11.2g,三羟甲基氨基甲烷1.21g,溶解于约800ml蒸馏水中,用盐酸调PH到7.4最后再,用蒸馏水定容至l00ml,放置于冰箱中保存备用。
氯化钙(Cacl2)溶液称取氯化钙5.0g,用蒸馏水定容至100ml。
0.1mol/L的Tris—Hcl缓冲液(PH7.4)称取三羟甲基氨基甲烷1.21g,加约80ml蒸馏水溶液,用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至100ml,放置于冰箱中保存备用。
过氧化羟基异丙苯溶液称取过氧化羟基异丙苯0.65g,用蒸馏水定容至l00ml。
盐酸苯胺溶液称取1029g盐酸苯胺,用蒸馏水定容至l00ml。
70%三氯乙酸溶液称取三氯乙酸70g,用蒸馏水稀释至100ml。
碳酸钠溶液(Na2CO3)溶液称取10.6g,无水碳酸钠用蒸馏水溶解并稀释100ml。
氢氧化钠(NaOH)溶液称取氢氧化钠4g,用蒸馏水溶解并稀释200ml。
酚试剂量取苯酚溶液2ml,加NaOH溶液至100ml。
0.25mol.L-1对-氨基酚标准溶液精确称取27.28mg对-氨基酚,用少量的蒸馏溶解后转移入1000ml容量瓶中加水定容至1000ml。
2方法
2.1实验动物的分组和染毒方式
各组的饲养管理条件相同。
实验期间细心观察各组小鼠的情况。
2.2样本的采集和处理
2.2.1小鼠肝微粒体的制备(钙沉淀法)
将小鼠停食24h后,颈椎脱臼处死,,迅速剖开腹腔取出肝脏,用预冷的生理盐水洗净血污,并用滤纸吸干表面的水分。
将肝脏称重后置于烧杯中,用手术直剪剪碎,按每克肝脏3ml的比例加入蔗糖—Tris—Hcl缓冲液,用电动玻璃匀浆机匀浆,转速600r/min分,研磨上下移动8次。
将匀浆倒入量筒,用缓冲液洗涤匀浆管并将其倒入量筒中,最后缓冲液的体积加至约5ml/g组织。
将肝匀浆转移到离心管中,以600r/min平衡离心5min,弃取沉淀部分(细胞碎片和细胞核),上清液以12000r/min离心10min,弃取沉淀部分(线粒体)。
量取去除线粒体的上清液的总体积,加入Cacl2溶液2ml,以14000r/min离心15min,弃取上清液,沉淀部分即为粉红色,半透明的微粒体。
将微粒体沉淀,混悬于Kcl-Tris-Hcl缓冲液中,并用玻璃匀浆器充分混均匀,再经14000r/min离心15min,其沉淀即为经清洗的微粒体。
最后将制备所获得微粒体悬混于Kcl-Tris-Hcl缓冲液(缓冲液用量约为1ml/g组织)中,用玻璃匀浆器充分混均匀,并分装后放置于冰箱中保存。
使用前按双缩脲法测定微粒体蛋白的含量。
2.2.2微粒体蛋白含量的测定(双缩脲法)[8]
取6只试管,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准酪蛋白质溶液,再分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0毫升蒸馏水,然后加入1.0毫升双缩脲试剂在室温放置30min,于540毫微米波长下比色,最后光密度以Y表示,酪蛋白的含量以X表示,计算出曲线的回归方程一。
吸取1毫升微粒体混悬液,加入1.0毫升的蒸馏水和4.0毫升双缩脲试剂,与前同样比色,根据吸光度和回归方程一求出微粒体混悬液蛋白的含量。
2.2.3苯胺羟化酶的活力的测定[9.10]
取清洁干燥的试管按表1加入试剂,将上述各试管置于37℃水浴预温3min后,按顺序每管加入过氧化羟基异丙苯0.1ml,继续水浴震荡3min,按顺序每管加入三氯乙酸溶液0.3ml,微粒体悬混液0.5ml。
经2000r/min离心10min后,分别将各管的全部上清液取于另一试管中,加入1ml酚试剂,室温下反应30min。
以1号试管作参比,在630nm处比色测定,以吸光度为Y,对-氨基酚的含量为X,算出回归方程二。
表1标准液的配制
试管编号
缓冲液(ml)
对-氨基酚标准液(ml)
相当于对-氨基酚(nmol)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.7
0.5
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.8
25
50
75
100
125
150
200
250
取清洁干燥的试管按表2加入试剂:
表2:
样品测定液的配制
空白对照管(ml)
样品测定管(ml)
微粒体
缓冲液
苯胺溶液
蒸馏水
—
以下的操作除不再加微粒体外,其余步骤与标准曲线操作相同。
以空白管作为参比,测样品管测的光密度值,依据回归方程二求出对应的对-氨基酚含量(nmol),并按下式计算苯胺羟化酶的活力。
苯胺羟化酶的活力(nmol/mg.min)=
生成的对-氨基酚含量(nmol)/微粒体蛋白浓度(mg/ml)×
0.5×
2.3统计方法
用SPSS11.0forwindows软件对试验数据的进行统计分析,试验数据以(
)表示,确定差异显著性作t检验,以P<
0·
05为差异具有统计学意义。
3结果与分析
3.1回归方程一
根据表3所测的数据计算出回归方程一为Y=0.065+1.76X,r=0.9908根据回归方程一计算出的蛋白质的含量,见附录。
根据表4的数据[14]求出的回归方程二:
Y=0.021+2.858×
10–3X,r=0.9802根据回归方程二计算出对-氨基酚的含量,见附录。
根据公式:
苯胺羟化酶活力(nmol/mg.min)=生成对氨基酚的含量/微粒体蛋白浓度,计算出苯胺羟化酶活力见表5。
表3:
标准蛋白质溶液的吸光度
相当于蛋白质(mg/ml)
吸光度
10
0.057
0.195
0.266
0.470
0.557
3.2回归方程二
表4:
标准液的吸光度
0.069
0.159
0.198
0.302
0.424
0.530
0.594
0.681
表5恩诺沙星对苯胺羟化酶活力影响(
,n=5)
组别
染毒剂量
苯胺羟化酶的活力
(nmol/mg.min)
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
50mg/kg
100mg/kg
15
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