流式细胞术应用概述PPT课件下载推荐.ppt

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获取的数据分析结果更具有统计学意义；

通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。

此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒,FACSCalibur,特点：

光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析,临床型（台式机）,流式细胞仪可检测的细胞参数,细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量,细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度,流式细胞仪分析数据常见图形：

（二维）点阵图（DotPlot）,适用于：

双参数分析,流式细胞仪分析数据常见图形：

直方图（HistogramPlot）,适用于：

单参数分析仅需要观察某个荧光强度的变化,流式细胞仪分析图谱,SSC（侧向散射光）-反应细胞内颗粒多少,FSC（前向散射光）-反应细胞大小,散射光信号,特征信息荧光（Fluorescence）信号,FL1（第一荧光）-FITC（异硫氰酸荧光素）FL2（第二荧光）-PE（藻红蛋白）FL3（第三荧光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四荧光）-APC（藻青蛋白）,流式细胞仪分析图谱,双色直接染色,设门：

选择要分析的细胞群体,设定阴性、阳性范围,流式细胞术在临床检测和科研中的应用,第二部分,一、免疫学检测和科研应用,1、细胞表面分子标记（以淋巴细胞亚群检测为例）,原理,人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：

T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。

T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4和CD8T细胞两个亚群；

B淋巴细胞特异性标志为CD19；

NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。

进而得到各亚群的比例。

T淋巴细胞,淋巴细胞亚群检测：

Tcells,Tsubsets,NKcells,Bcells,淋巴细胞亚群及功能,CD4+CD25+CD127-Treg检测,淋巴细胞亚群及功能,淋巴细胞亚群与疾病,淋巴细胞亚群检测意义,疾病机理研究,疾病辅助诊断,移植后免疫检测,治疗方案的确定及疗效评价,CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染0.2时,必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨细胞病毒感染,慢性疲劳,感染后综合征,纤维肌痛,类风湿性关节炎,过敏等,疾病预防,淋巴细胞亚群检测意义,鉴别活动期和非活动期SLE,2、胞内分子流式细胞术检测（以Th1/Th2细胞因子检测为例）,Th1/Th2细胞,Th1/Th2细胞,Th1型细胞因子介导细胞免疫反应引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症刺激来源：

病毒、某些细菌Th2型介导体液免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促进I型变态反应（过敏反应）刺激来源：

多细胞寄生虫、过敏原,Th1/Th2细胞,PMA+Ionomycin刺激4-6hr,流式细胞术检测胞内细胞因子,新鲜分离PBMC加PMAIo刺激后6h测定胞内细胞因子IL-4和IFN-g,Th1/Th2失衡相关疾病,胞内寄生的病原生物感染性疾病Th1细胞及其细胞因子保护性免疫Th2细胞及其细胞因子发病，如结核病，或慢性感染变态反应性疾病Th2细胞及其细胞因子过敏性哮喘等（IgE）自身免疫性疾病Th1细胞及其细胞因子常为炎性增强的标志Th2细胞及其细胞因子免疫耐受/抑制有关肿瘤免疫Th2细胞及其细胞因子肿瘤发病，,Th1/Th2细胞检测意义,疾病治疗,发病机制研究,使用Th1和Th2相关的细胞因子IFN-治疗麻疯病,用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染,使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物:

萨力多胺（Thaliodomide）治疗巨细胞动脉炎,疾病治疗监测,二、流式细胞术在肿瘤学中的应用,肿瘤发生发展,1、DNA倍体和细胞周期分析,细胞周期和DNA倍体分析的原理,1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平,2、性细胞DNA含量为1C,3、处于增殖期至分裂期细胞由2C增加至4C,4、凋亡细胞DNA断裂,含量2C,细胞经荧光染料（碘化丙啶，PI）染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相（G0/G1、S和G2/M期）的DNA含量（），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量,Diploid:

100.00%DipG1:

54.38%at46.90DipG2:

15.91%at91.61DipS:

29.71%G2/G1:

1.95%CV:

5.23,G0/G1,S,G2/M,Diploid:

64.50%DipG1:

92.45%at49.24DipG2:

2.30%at98.48DipS:

5.26%G2/G1:

2.00%CV:

3.21Aneuploid1:

35.50%An1G1:

97.69%at58.53An1G2:

0.00%at123.89An1S:

2.31%G2/G1:

2.12%CV:

3.14DI:

1.19,可检测标本,新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺物等。

冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡块）。

通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。

蜡块包埋的标本需进行特殊处理,意义,70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变,1.RossJS.DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology.NewYork:

Igaku-Shoin;

1996:

47-60,DNA倍体和S期比例-指导治疗2卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症-早期（I/II期）DNA倍体和DNA指数-预后长期和无病生存期2卵巢癌-晚期,2.TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry.HCFAWebsite,1999,2、肿瘤相关基因编码蛋白检测,P53,乳腺癌,与病理学分级有关,并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关,大肠肿瘤,早期发现大肠癌,胃癌,与预后相关,肝细胞癌,与组织分级,肿瘤预后,转移及肿瘤大小密切相关,Bcl-2,Bcl-2在正常组织中的表达,造血系统细胞淋巴,单核细胞等受激素或生长因子调节的腺上皮前列腺上皮,子宫内膜等干细胞或增值细胞皮肤的基底细胞,肠上皮寿命长的分裂细胞神经元胚胎组织,Bcl-2在肿瘤组织中的表达,肾脏肿瘤肾癌,肾盂乳头瘤,Wilms瘤,肾嗜酸细胞瘤前列腺癌B细胞性淋巴瘤乳腺癌（43%）甲状腺癌,nm23,nm23与多种肿瘤的转移及预后相关,肝细胞癌甲状腺肿瘤乳腺癌结肠癌肉瘤,CD44（CD44s/CD44v）,3、Cyclin（细胞周期蛋白）检测,P-gp在肿瘤组织中的表达,乳腺癌,膀胱癌,胃癌,食管癌,卵巢癌,前列腺癌等,化疗前高表达,化疗后高表达,肾细胞癌,结肠癌,肝癌,肾上腺皮质癌,胰腺癌等,化疗前低表达,非何杰金氏淋巴瘤,成神经细胞瘤,急性髓白血病等,化疗不敏感,化疗敏感,化疗不敏感,4、肿瘤多药耐药性（MDR）检测,4、凋亡检测,详见下一部分,三、流式细胞术分析凋亡,细胞凋亡与疾病的关系该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。

细胞凋亡不足：

肿瘤，自身免疫病细胞凋亡过度：

心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染不足与过度并存：

动脉粥样硬化,凋亡与疾病,细胞凋亡过程,在凋亡诱导因素的作用下,线粒体的膜电位改变,caspase家族激活,磷脂酰丝氨酸外翻,DNA断裂形成凋亡小体,凋亡的检测方法,1.形态学检测光学显微镜荧光显微镜（Hoechst33342，Hoechst33258,DAPI）电子显微镜2.磷脂酰丝氨酸外翻分析（可用FCM）3.线粒体膜势能的检测（可用FCM）4.DNA片断化检测（可用FCM）5.TUNEL法（可用FCM）6.Caspase-3活性的检测（可用FCM）7.凋亡相关分子的检测（可用FCM）促凋亡分子:

Bax,Bcl-Xs,Bak,Bad,Bid等抑凋亡分子:

Bcl-2,Bcl-XL和bcr/ablkinase等8.相关信号通路分子的检测（可用FCM）,1.磷脂酰丝氨酸外翻分析（ANNEXINV标记法）,【原理】细胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸（PS）外翻；

Annexin-V能与PS高亲和力特异性结合；

碘化丙啶（propidineiodide,PI）可以区分活细胞和死细胞。

结果分析,结果分析-优,结果分析-差,如何获得好的结果,细胞状态要好；

细胞处理的火候问题：

药物浓度、时间需要摸索；

染色后，不能固定细胞，应尽快检测。

2.线粒体膜势能的检测,【原理】线粒体跨膜电位的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡则不可逆转。

线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

常用染料有：

Rhodamine123、3，3-DihexyloxacarbocyanineiodideDiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodideJC-1、Tetramethylrhodaminemethylester（TMRM）等,结果分析,3.DNA片断化检测,通过PI染色，分析亚二倍体峰（凋亡峰），方法同“DNA倍体分析和细胞周期分析”,4.TUNEL法,流式也能进行TUNEl检测，其检测原理与经典TUNEl原理基本一致。

利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。

流式检测后，可以进行精确的计算凋亡百分比。

这一点，经典TUNEl是做不到的。

经典TUNEL法原理,结果分析,结果分析,结合细胞DNA含量分析效果更佳,5.Caspase-3活性的检测,Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子。

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

用荧光标记的抗活化Caspase-3的抗体进行胞内染色，可以通过流式细胞术分析其活性在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降,四、流式细胞术在血液学中的应用,1、流式细胞术白血病免疫分型,白血病细胞起源、分化和生物学行为不同，构成了白血病的异质性，因此急性白血病的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。

急性白血病的分型基本上分三个阶段：

FAB分型（1976）（morphology，M）,MIC分型（1986）（morphology，M）（immunology，I）（cyto