红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验Word下载.docx
- 文档编号:14113248
- 上传时间:2022-10-18
- 格式:DOCX
- 页数:7
- 大小:19.75KB
红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验Word下载.docx
《红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验Word下载.docx(7页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
4.水浴箱〔37℃,56℃〕
5.台式离心机
6.多道可调加样器、单道可调加样器
7.离心管
8.96孔微量血凝板〔使用豚鼠和人红细胞进展实验须用“U〞底板,使用火鸡红细胞进展实验用“V〞底板〕
9.200µ
L、1000µ
LTIP头、水槽
表1.流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较
红细胞
火鸡
豚鼠
人“O〞型血
终浓度
0.5
孔底部形状
V型
U型
孵育时间
25-30min
45-60min
红细胞沉积形状
细胞沉积成点状,倾斜时细胞向下流成泪滴状
细胞沉积成环状
〔四〕流感病毒鉴定和抗原分析步骤
1.实验前准备
(1)标准参考抗血清的处理
1)去除血清中的非特异性抑制素
a)所谓抑制素是指各种动物血清、体液、组织液中所含与红细胞外表受体相似的物质,它们能与红细胞受体一起竞争性地被病毒外表血凝素所识别和结合。
目前所知道的非特异性抑制素,除大白鼠血清中对丙型流感病毒特殊的非特异性抑制素,还有三种:
α、β和γ。
在HAI试验中,必须将非特异性抑制素从抗血清中去除干净,才能准确地测定出HAI的抗体效价。
常用的去除非特异性血凝抑制素的方法有霍乱滤液〔RDE,受体破坏酶的一种〕去除法,过碘酸钾去除法等。
b)RDE处理步骤:
用25mL生理盐水稀释RDE;
在1体积血清中参加3体积RDE〔如0.1mL血清+0.3mLRDE〕,37℃水浴16-18h;
56℃水浴30min;
参加6体积生理盐水〔在0.4mLRDE和血清混合物中参加0.6mL生理盐水〕。
2)去除非特异性凝集素
a)向20体积RDE处理后的血清中参加1体积的纯血球。
b)完全/彻底混匀,在2-8℃孵育,每15min重新混匀一次。
c)1h后,2000转离心5min。
吸出血清上清液。
d)取出一块96孔血凝板,在第一列每孔参加50uLPBS缓冲液,吸出50uL处理好的血清,做2倍稀释,参加50uL红细胞悬液,室温静置30-60min,观察试验结果,如果红细胞沉积,证明血清中非特异性凝集素去除干净〔去除非特异性凝集用红细胞类型与下一步试验用红细胞类型一致〕。
(2)红细胞悬液配制
1)A.S液全称为Alsever氏液。
配制方法为葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g、去离子水加至100mL,微热溶解,将pH值调到6.1,8磅20min高压灭菌,4℃贮存备用。
2)将含有红细胞的A.S液,离心5min〔火鸡/鸡红细胞1800rpm;
人“O〞型、豚鼠红细胞2000rpm,不同离心机转速稍有不同〕,弃上清。
3)参加等量的PBS缓冲液洗涤,充分混匀,离心5min〔转速同上〕,弃上清。
PBS缓冲液洗涤三次。
最后一次洗涤后,离心10min〔转速同上〕,弃上清。
4)吸出适当体积的红细胞,用PBS缓冲液配制成工作浓度为1%红细胞悬液。
2.流感毒株HA滴度的测定
(1)在微量血凝板的第2~12列参加50µ
LPBS缓冲液。
(2)在第一列〔A1~G1〕中参加100µ
L病毒悬液。
(3)H1参加100µ
LPBS,作为红细胞阴性对照。
(4)从第一列各孔吸50µ
L病毒液,由第1列至第12列做2倍系列稀释,最后一列每孔弃去50µ
L。
(5)在每孔中参加50µ
L红细胞悬液,轻拍血凝板,充分混匀。
(6)室温孵育,鸡和火鸡红细胞静置25-30min后观察结果,人“O〞型和豚鼠红细胞45-60min后观察结果,并记录。
3.HA试验结果判断
引起全部红细胞凝集为完全凝集,以“+〞记录;
只有局部红细胞凝集记录为“+/-〞;
无凝集记录“-〞。
血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点,其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。
表2.HA滴度判定举例
病毒稀释度
HA滴度
1:
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
2048
3
5
6
7
9
10
11
12
A
+
-
B
C
D
E
F
G
≥2048
H
<1
4.制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原
(1)一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。
进展红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量。
(2)制备4个单位血凝抗原时,首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。
如每种血清做8孔稀释,每孔用抗原25µ
L,那么测定一份血清需0.2mL抗原。
根据标准抗血清的份数计算出实验所需病毒抗原总量。
(3)其次,计算出病毒稀释度。
用病毒的HA滴度除以8,得到的商即为配置4个血凝单位所需的稀释度。
如,某病毒的HA滴度为64,除以8等于8,那么1:
8〔1mL病毒液加7mLPBS缓冲液〕稀释该病毒即可得到4个血凝单位的抗原。
注:
红细胞凝集抑制试验中所用的4个血凝单位是指每25µ
L病毒液中含有4个血凝单位〔等于50µ
L病毒液中含有8个血凝单位〕。
表3.所需抗原总量为1600µ
L时,4个血凝单位配置对照表
病毒液(µ
L)
PBS(µ
800
400
1200
200
1400
100
1500
50
1550
25
1575
12.5
1587.5
6.25
1593.75
5.4个血凝单位抗原的复核滴定
(1)为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误,新配置的4个血凝单位抗原需复核滴定。
操作方法同HA实验步骤。
(2)如果只有前4孔出现凝集,说明每50µ
L病毒含有8个血凝单位,该病毒稀释准确,可以用于红细胞凝集抑制试验。
如第5孔也出现凝集,说明每50µ
L病毒含有16个血凝单位,该抗原必须等量稀释。
如只有前3孔凝集,说明每50µ
L病毒仅含4个血凝单位,病毒量需加倍。
此外,4个血凝单位抗原必须每次现用现配。
6.红细胞凝集抑制试验〔HAI〕
(1)利用HAI方法进展流感病毒的鉴定
红细胞凝集抑制试验〔HAI〕鉴定未知病毒,每块96孔血凝板可以检测两株未知病毒。
1)在血凝板的第1-5、7-11列每孔参加25µ
LPBS缓冲液,第6和12列每孔参加50µ
LPBS。
然后在A1-A4、A7-A10各孔分别参加:
抗A(H1N1)pdm09流感病毒标准参考血清、抗季节性A(H3N2)流感病毒标准参考血清、抗B-Yamagata系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感病毒标准参考血清25µ
L,用多道移液器从A1-A4、A7-A10行每个孔分别取25µ
L,由A至H行做2倍稀释血清,最后一行弃去25µ
2)第1至4各列每孔参加25µ
L4血凝单位待检抗原1,A7至A10各列每孔参加25µ
L4血凝单位待检抗原2。
第5和第11列参加25µ
LPBS缓冲液,作为红细胞对照。
第6和第12列第一孔分别参加50µ
L8血凝单位待检抗原1和2,由A至H行做2倍稀释,最后一行弃去50µ
L,此处做法的目的是HAI实验同时验证所配置4单位抗原的准确性,确保实验结果准确。
a)阳性对照:
将试剂盒中的各型/亚型流感病毒标准参考抗原按照上述步骤进展检测。
3)轻拍,混匀,室温孵育30min。
4)每孔参加50µ
L配置好的红细胞悬液,轻拍混匀,室温静置30-60min,观察血凝抑制实验结果〔具体孵育时间根据使用的不同种类血球来定,详见表1〕。
(2)利用HAI方法进展流感病毒的抗原分析
1)验证4血凝单位抗原步骤同以上,如果4血凝单位结果不准确需重新配置,直至回滴结果准确为止,在进展抗原分析时4血凝单位抗原一定要配制准确,保证病毒之间抗原分析结果有可比性。
2)在微量血凝板的第1-11列每孔参加25µ
LPBS缓冲液,第12列每孔参加50µ
LPBS缓冲液。
在第一行〔A1-A11〕每孔参加25µ
L对应待检流感病毒型/亚型的抗原分析用参考抗血清及阴性对照血清。
3)从第一行〔A1-A11〕各孔混匀之后吸取25µ
L血清,由第1行至第8行做2倍系列稀释,最后一行每孔弃去25µ
L液体。
4)在微量板的第1-11列每孔参加25μL配制好的4血凝单位抗原,第12列A12孔参加50µ
L配置好的8血凝单位抗原,由第1行至第4行做2倍系列稀释,最后一行每孔弃去50µ
第12列的E、F、G、H孔做红细胞对照,轻拍微量板,室温孵育30min。
5)在微量板的每孔参加50µ
L的红细胞悬液,轻拍微量板,使红细胞与病毒充分混合。
6)室温静置30-60min〔具体孵育时间根据使用的不同种类血球来定,详见表1〕。
观察血凝抑制实验结果。
7.结果判读
红细胞凝集抑制效价是指血凝现象完全被抑制时血清的最高稀释度的倒数。
如1:
80稀释的血清孔不出现凝集〔凝集现象完全被抑制〕,1:
160稀释的血清孔出现凝集〔凝集现象没有被完全抑制〕,该血清对测定病毒的红细胞
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 红细胞 凝集 抑制 试验
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)