补阳还五汤对老龄大鼠脑缺血再灌注海马齿状回细胞增殖分化的阻碍Word文件下载.docx
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【关键词】补阳还五汤;
老年;
脑缺血再灌注;
神经干细胞;
增殖;
分化;
大鼠
脑缺血再灌注可激活脑内神经干细胞发生增殖、迁移〔1〕。
以往缺血性脑血管疾病的实验研究多轻忽脑血管疾病中增龄因素的重要性,致使青年动物的实验研究结果与临床有较大差距,有关老龄大鼠神经再生特点鲜见报导。
补阳还五汤(BHD)医治脑梗死具有明显成效〔2〕,机制可能与其改善微循环和拮抗血栓形成及细胞凋亡有关〔3,4〕。
本研究以老龄大鼠为研究对象,从海马齿状回细胞增殖和分化的转变等方面揭露补阳还五汤拮抗老年脑缺血再灌注损伤机制。
1材料与方式
实验动物和药剂SD雄性20~21月龄大鼠96只(450~600g,动物合格证号:
医动字第410117号,由河南省实验动物中心提供)。
5溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、兔抗大鼠BrdU、兔抗大鼠神经元核抗原(NeuN)、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(均由博士德生物工程提供);
尼莫地平片(批号:
0312079;
规格:
20mg/片由山东新华制药股分提供);
BHD按《医林改错》原方所载的药方比例,按每钱3g换算(生黄芪120g,当归6g,赤芍g,地龙、桃仁、红花、川芎各3g,药材购自河南中医学院附属门诊部并经鉴定),煎两次,40min/次,归并后浓缩为含生药2g/ml,4℃冷藏备用。
动物分组、模型制备及BrdU标记采纳改良的Bederson等〔5〕法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。
设假手术组、模型组(依照缺血及再灌注时刻不同分为缺血3h,再灌注一、3、7、14d)、尼莫地平组(6mg·
kg-1·
d-1)、BHD组(13g·
d-1),每组每一个时刻点为6只大鼠,造模前5d开始灌胃给药,造模前2h加灌一次,假手术组和模型组灌生理盐水。
各组均于术后4h腹腔注射10g/LBrdU(50mg/kg,1次/d)。
4%多聚甲醛灌注固定,断头取脑,脱水固定,石蜡包埋切片(免疫组化、光镜病理)。
观看指标及方式
神经功能障碍评分参考吴俊芳〔6〕提出的8个品级评分标准,各组各时刻点动物均进行神经功能障碍评分。
脑组织含水量各组各时刻点动物均断头取脑组织,标本用分析天平别离测定其湿重及在电热恒温干燥箱中100℃干燥48h后的干重,以计算含水量。
公式如下:
含水量=(湿重-干重)/湿重×
100%。
余脑组织脱水固定,石蜡包埋切片(光镜病理、免疫组化)。
病理观看各组各时刻点动物均常规HE染色,光镜下进行病理观看。
%戊二醛溶液、1%锇酸固定,常规制作超薄切片,经醋酸铀及柠檬酸铅双染色后,透射电镜下观看神经细胞、胶质细胞和毛细血管等超微结构。
BrdU、NeuN和GFAP测定BrdU阳性细胞采纳免疫组化方式测定、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP采纳双标记染色,全自动彩色图像处置系统进行图像分析,各组各时刻点每只大鼠随机选取5张非持续的脑片,在×
400镜下,每张切片取缺血侧的DG个3个视野,计数BrdU阳性细胞数;
双标结果每张切片选取10个视野,计数BrdU阳性细胞及BrdU/NeuN或BrdU/GFAP双标细胞,计算双标细胞阳性率。
统计学处置应用软件包进行统计分析,采纳方差分析统计处置,数据均以x±
s表示。
2结果
病理观看老龄模型组(I/R1d、I/R3d)可见神经元、神经胶质细胞肿胀,排列紊乱,显现典型的梗死灶,神经元数量减少。
血管周围高度水肿、结构欠清楚,炎性细胞浸润明显,形成“血管套”。
BHD组可见神经元、神经胶质细胞排列轻度紊乱,部份细胞显现细胞核固缩、深染及肿胀。
血管轻度扩张水肿,部份血管受压变形,管周围有炎性细胞浸润,细胞间隙轻度水肿。
与同时刻点模型组比较病理损伤均减轻,该药物能够明显减轻脑缺血再灌注损伤。
电镜观看模型组3h后神经元、胶质细胞胞质显现水肿,线粒体水肿,嵴和膜消失,内质网脱颗粒,染色质浓缩及边缘聚集。
3d超微结构破坏达到最严峻,胞质、胞核高度水肿,线粒体水肿,嵴模糊、消失。
7~14d细胞超微结构破坏略减轻。
尼莫地平组14d神经元、胶质细胞、血管内皮细胞超微结构较模型组病理转变明显减轻,仅见线粒体嵴排列轻度紊乱,粗面内质网轻度脱颗粒,可见大量线粒体,线粒体周围轻度水肿。
BHD组3d以后脑细胞的超微结构病理转变明显减轻,胞质中可见脂褐素,线粒体仅有轻度水肿,嵴底部份消失,膜部份消失,粗面内质网正常,其余细胞器正常,14d观看细胞质、胞核、细胞器大体正常。
BHD对脑组织含水量和神经病症积分转变的阻碍模型组脑组织含水量(I/R一、3、7d)、神经病症积分(各时刻点)均高于假手术组;
BHD组神经病症积分、脑组织含水量(I/R3、7、14d)低于模型组;
BHD组神经病症积分(I/R7、14d)低于尼莫地平组。
见表1。
BHD对海马齿状回BrdU、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP阳性细胞数量的阻碍模型组BrdU阳性细胞(各时刻点)、BrdU/NeuN双标阳性细胞(各时刻点)、BrdU/GFAP双标阳性细胞(I/R7、14、21d)数量均高于假手术组;
BHD组BrdU阳性细胞(各时刻点)、BrdU/NeuN双标阳性细胞数量(各时刻点)高于模型组,BrdU/GFAP双标阳性细胞(I/R3、7、14d)转变相反;
BHD组BrdU阳性细胞(I/R7、14d)、BrdU/NeuN双标阳性细胞(I/R7d、I/R14、21d)数量高于尼莫地平组。
见表2。
表1BHD对老龄大鼠脑组织含水量和神经病症积分阻碍比较表2BHD对海马齿状回BrdU、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP阳性细胞数量的阻碍与假手术组比较:
1)P&
lt;
2)P&
;
与模型组相同时刻点比较:
3)P&
4)P&
与尼莫地平组相同时刻点比较:
5)P&
6)P&
3讨论
脑梗死是临床上常见的缺血性脑血管疾病,致残率和致死率均较高。
脑缺血后常引发神经元丢失,致使神经功能缺失。
目前,关于脑缺血损伤后的功能恢复要紧集中在增进内源性神经干细胞增殖和干细胞移植〔7〕。
尽管脑缺血后成年脑内增殖区的细胞发生明显的增殖性反映,但由于细胞数量有限可能不足以产生功能恢复性阻碍。
尽管外源性的干细胞移植可弥补上述不足,但由于干细胞移植需要外在的细胞资源如胚胎非人类组织和培育的细胞,这些移植物的应用,可能引发新的疾病、免疫排斥和需要长期利用免疫抑制剂等问题。
神经再生出此刻成年脑内不持续的区域,要紧包括海马齿状回颗粒基层、侧脑室室管膜及室管膜下区两个要紧聚集区域,侧脑室室管膜及室管膜下区新生的神经元可通过嘴侧迁移流移至嗅球和皮层;
海马齿状回颗粒基层新生的神经元可移至海马颗粒层〔8〕。
因此,动员内源性干细胞的神经发生是增进脑缺血后损伤修复的有效途径。
气虚血瘀证贯穿于脑卒中病的始终,益气活血为医治脑卒中之大法。
BHD由黄芪、归尾、川芎、桃仁、红花、芍药和地龙等药物组成,具有补气活血、通经活络功效,可有效改善脑血流及血液流变,拮抗兴奋性氨基酸毒性及合理调控一氧化氮合成酶(NOS)的表达,拮抗脑缺血及再灌注损伤,要紧用于医治缺血性脑梗死及其后遗症〔3,4,9〕。
BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核昔类似物,在细胞S期能够标记DNA合成,为胞核表达活性物,标记细胞核,因此BrdU阳性细胞可被看做具有增殖活性的细胞〔10〕。
Kawai等〔11〕采纳四动脉阻断法制作成年大鼠短暂性全脑缺血模型,观看到缺血后五、7、9dDG中BrdU细胞数增加,28d时增殖细胞分化为神经元。
Zhang等〔12〕利用大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,发觉室管膜下区(SVZ)的NSCs在缺血后1d即开始增殖,11d达到顶峰,脑缺血不仅能够促使缺血侧SVZ和颗粒基层(SGZ)的NSCs增殖,而且可阻碍到对侧大脑半球SVZ和SGZ的NSCs,其增殖效应并非依托于增殖区局部是不是有受损的神经元,这一进程可能是机体对缺血损伤产生的神经爱惜反映。
本组资料说明,BrdU阳性细胞胞核有两种形态:
一种胞核较大深染呈圆形,另一种胞核淡染呈椭圆形,但以前者为主。
胞核的形态转变和染色深浅可能与脑老化和神经干细胞的分化有关,胞核大深染呈圆形的分化为神经元,淡染呈椭圆形多分化为胶质细胞。
正常成年脑组织中,海马中只有少量BrdU阳性细胞存在,脑梗身后BrdU阳性细胞数量明显增加,出此刻海马(颗粒层和齿状回更为明显)、SVZ及梗死边缘,7~14d达顶峰,后渐减少,说明脑梗死能够诱导脑内自体神经干细胞原位增殖,但这不是脑梗死的直接结果,可能是引发了脑内某些因子的转变,通过不同途径作用于脑内处于静止期的神经干细胞引发增殖改变。
补阳还五汤作用后1dDGBrdU阳性细胞明显增加,7d达顶峰,14d仍维持较高水平,较模型组(各时刻点)和尼莫地平组(I/R7、14d)BrdU阳性细胞明显增多,且增殖顶峰提早,持续时刻延长,说明补阳还五汤可增进DG神经细胞增殖,并在一按时刻窗内增强,这为临床医治能够初期给药提供了理论依据。
NeuN是神经元的标记蛋白〔13〕,GFAP是星型胶质细胞活化及增殖的标志物〔14〕,BrdU/NeuN双标阳性细胞代表增殖的神经干细胞向神经元分化,BrdU/GFAP双标的阳性细胞代表增殖的神经干细胞分化方向为神经胶质细胞。
本研究结果显示,BrdU/NeuN+和BrdU/GFAP+细胞在脑缺血后3d开始增多,7~14d达顶峰,说明脑缺血激活了原位神经干细胞的增殖,慢慢向神经元和神经胶质细胞分化。
BHD医治后,BrdU/NeuN+1d即开始增多,14d达顶峰,后渐减少,而BrdU/GFAP+细胞数量顶峰推延;
较模型组(I/R3、7、14、21d)和尼莫地平组(I/R7、14d)BrdU/NeuN+细胞数增多,BrdU/GFAP+细胞数量下调(I/R7、14d),提示BHD可有效刺激神经干细胞向神经元分化,且持续时刻长,而神经胶质细胞分化减少,抑制了过强的胶质细胞反映,亦说明针刺具有增进胶质细胞向神经细胞转化的作用趋势。
【参考文献】
1SalazarColochoP,LanciegoJL,delRioJ,etinducesc
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