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b干扰微生物酶系统各的影响其代谢
c损伤微生物细胞膜,使内容物逸出。
3)生物因素。
在微生物之间,微生物与寄主动植物之间均存在着各种互相作用的关系,主要为寄生、共生、拮抗关系等。
噬菌体与寄主菌、细菌素对某些细菌的抗菌作用,就是生物因素的具体表现。
四、微生物代谢及其在生长检定中的意义
微生物生化鉴定试验,所使用的基本原理,就是利用微生物所物有的代谢反应,其中大部分波及到酶的反应
1)微生物主要代谢内容
A、呼吸作用-根据微生物呼吸作用最终电子受体性质分为呼吸作用,无氧呼吸作用及发酵作用三种,无本质区别,都是物质被氧化,同时另一物质被还原只是物质被氧化分解程度和释放水平不同。
相关的生化鉴反应
如过氧化氢酶试验,硝酸盐还原试验,氰化钾试验等。
B、糖的分解
有关的生化鉴定反应
如糖(醇、苷)类发酵试验,葡萄糖的氧化/发酵试验,甲基试验,甲基红试验,VP试验
C、蛋白质和氨基酸的分解
相关生化鉴定试验
如吲哚试验、明胶液化试验、硫化氢试验等。
(2)、微生物酶
酶是由细胞产生的特殊蛋白质或特殊蛋白质复合物,并能催化各种生物化学反应的有机催化剂,与一般无机催化剂相比,酶能在常温压下进行催化,有催化效率高和高度专一性的特点。
如糖代谢试验中的B-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)蛋白质和氨基酸的代谢中的氨基酸试验等。
二、药品中常见几种微生物的介绍
1、细菌一般知识
细菌形态多样,个体较小,一般的1~10UM
细菌细胞结构:
粘液层和夹膜-血清学分理
细胞壁-革兰氏染色
细胞膜-生化鉴别(蛋白质分解)
细胞质
核质-DNA
附属器官(鞭毛、菌毛、芽孢)--识别、签定细菌种类重要特征
细菌生长变化过程:
1、诱导期2、对数生长期3、稳定期4、死亡期
细菌的群体形态:
1、菌落2、菌苔3、液体培养物质形态
细菌在液体培养基内的生长现象,基本上分为混浊、菌膜、沉淀三种。
以药品中检验的细菌为例,大肠埃希氏杆菌、沙门菌、志贺菌均为混浊生长;
铜绿假单胞菌为专性需氧菌,在培养基表面可形成菌膜,膜下混浊,越往下菌越少;
金黄色葡萄球菌也为均匀混浊生长,但有部分细菌可沉淀于管认底。
细菌菌种的鉴定方法:
1、菌种纯化2、鉴定的基本肉容
2、霉菌的一般知识
1、霉菌属于直菌,示指专营腐生或寄生生活的一群微小的丝状真菌,属真菌的一部分大多数霉菌属于无子实体的丝状真菌,具分枝的菌丝交织或菌丝体。
一部分菌丝可产生孢子进行繁殖产生子孙,一部分则吸取营养称营养菌丝。
霉菌菌落不是群体,一般为个体,由一个孢子萌发,生长而形成的菌丝支织而成为菌丝体
2、药品常见的霉菌属1)根霉属2)毛霉属3)犁头霉属4)基他
3、酵母菌一般知识
1、酵母菌多数为单细胞,一般呈卯圆形、圆形或圆柱形,常有芽体相连为真核细胞、有完整的细胞结构,具细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核及细胞器
2、常见的酵母菌属有1、酵母菌属,一般在液体培养时不产生菌酵,在长期培养后有的能生成菌酵2、裂殖酵母菌层,但薄而光滑,发酵产物主要为乙醇二氧化碳3、基它(汉逊氏酵母属,德巴利氏酵母属等)
4、在玫瑰红钠琼脂平板上的形态特征;
多为圆形微凸,边缘整齐,表面光滑显润,内层生长为圆形,铁饼形,纺锤形或三角形,有酒香味,它与霉菌极易区别,但若出现粘质如油香味,它与霉菌极易区别,但若出现粘质如油状细菌菌落时,两者较难区别,最可靠鉴别方法是显微镜检查,酵母菌个体比细菌大,绝大多数为出芽繁殖。
第二部微生物限度检查法
各国药典收载微生物限度检查法的时间
各国药典
中国药典
美国药典
英国药典
收载时间
1995
1975
1973---方法
1988---品种
1978年颁布第一个药品卫生标准;
1986年颁布了修改的药品卫生标准;
1989年下发药品卫生标准补充规定和说明。
中国药典1995年收载微生物限度检查法(标准仅为少数剂型)
一、前言及一般规定;
1、主要增修订内容
1)对微生物限度检查的实验环境进行了详细的规定,并指出了环境验证的依据。
2)调整了霉菌的培养温度,修改后温度和无菌检查法中真菌的培养温底一致,均为23~28摄氏度
3)对检验量的规定进行了调整,取消了口服药品不得少于3g,外用药品不得少于5g的规定,明确指出沙门菌检验用量应单独增加为10g或10ml。
2、实验环境
中国药典(2005年版)微生物限度检查法规定:
"
微生物限度检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气中进行
其全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染,单向流空气区域、工作台面及环境应定期按((医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法))的现行国家标准进行洁净度验证。
3、洁净室(无菌室);
设计要按国安标准-2001((洁净厂房设计规范))、国家药品监督管理局颁发的((药品检验所实验室质量管理规范(试行)))中第十八条规定执行。
微生物实验室洁净室的施工、安装、验收应按国家行业标准JGJ71-1990((洁净室的施工及验收规范))执行
4、洁净室(无菌室)的使用管理要做到以下工作:
1、要符合规范要求2、建立使用登记制度及使用标准操作规范(SOP)并严格管理。
包括温湿度观察要求、消毒要求及其它要求等。
1)消毒要求;
常用消毒剂,5~20倍稀释的碘伏水溶液,0.1%新洁尔灭溶液,1:
50
5、定期进行洁净度再验证定期(每季度、半年、1年)或当洁净室设施发生重大改变时,要按国家标准GB/T16292-16294-1996((医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法))进行洁净度再验证,以确保结净度符合规定。
洁净级别
尘粒数/(m的三次方)
浮游菌(个)/m三次方
沉降菌(个)/(90mm·
0.5h)
微粒直径≥0.5μm
微粒直径≥5μm
100级
≤3,500
≤0
≤5
≤1
10000级
≤350,000
≤2000
≤100
≤3
100000级
≤3,500,000
≤20,000
≤500
≤10
6、定期更换紫外灯管及净化系统的初中高效头,定期至少每年一次更换紫外灯管,以确保紫外灯管灭菌持续有效。
一般每2年1次初中效头。
7、定期监控超净工作台。
2、1、2菌种处理和微生物鉴别、验证、局部100级控制室(阳性室)
应培备一台净化工作台(最好是生物安全柜)
二、供试液的制备
1、药品微生物检验的特殊性
2、增修订内容
1)明确规定了供试液制备时使用水浴加热的温度和加热时间(温度为不大于45摄氏度。
2)明确规定了供试液从制备完毕到加入培养基的时间应不超过1小时
3)对非水溶性供试品,增订了使用十四烷酸异丙酯溶解供试液方法。
4)删除了2000版收载的所有稀释剂,增订了其他四种,分别为PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液和PH6.8无菌磷酸盐缓冲液以及PH7.6无菌磷酸盐缓冲盐
3、非水溶性供试品制备方法
十四烷酸异丙酯法
适用范围:
用于一法不能溶解,可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和黏性油剂供试品
十四烷酸异丙酯的用量同方法验证试验(无菌十四烷酸异丙酯的制备采用薄膜过滤法过滤除菌,选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜,在140度干热灭菌2小时):
无菌十四烷酸异丙酯,将购买的十四烷酸异丙酯用0.22
取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解。
然后加入45度PH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液100ml,振摇5~10min,萃取,静置使油水明显分层,取其水层为1:
10的供试液
3、抑菌活性的供试品的拱试液制备方法。
1)、药物的抑(抗)菌作用
2)抑菌性药品检查的理由A、可逆性B、抗菌谱C、细菌的耐药性
3)抑菌药物判定:
A、已知B、验证
5)制备方法
A、培养基稀释法取规定量的供试液,至较大量的培养机中使各单位体积内的供试品含量减少至不含抑菌作用减少,由于化学抑菌剂的抑菌效果与其浓度呈相关,即浓度越高,抑菌作用越强。
常用稀释法中和检品的抑菌性。
不同抑菌性的浓度与其抑菌效力间的相关性不同,但对某一特定的抑菌剂来说,这种相关性是恒定不变的,二者呈指数关系,可用下式表示:
Gt=k
式中,C表示抑菌剂的浓度;
t表示杀灭标准试验菌所需要的时间;
k是一个常数;
浓度指数η,是lgt与lgC做图做得直线的斜率。
抑菌剂的η值越高,其抑菌作用越易。
通过稀释而被中和掉,抑菌剂的η值越低则越难通过稀释法来中和消除其抑菌力。
本法适用抑菌作用不强的各类中西药制剂。
方法:
取同稀释级的供试液2ml,每1ml等量分注5个平皿,倾注培养基混匀,培养计数,分别计算5个平皿的平均菌落数,计算每1ml供试品的平均菌落数,按计数规则报告菌数。
B、离心沉淀集菌法
1)原理;
利用质量和比量的不同
2)溶液剂及可溶于水的固体供试品:
3000转/分离心20分,弃上留底液2ml。
3)难容于水的固体供试品:
500转/分离心5分,弃上留底。
6)抑菌作用弱的固体供试品;
也可一次低速离心取上层液直接入培养基
c中和法(灭活法)
一些抗菌药物的常用中和剂
抗菌药物
中和剂
苯酚、甲醇、酚类
稀释法(1:
20)
苯甲酸、对羟基苯甲酸酯
聚山梨醇80(1%)
汞类化合物
巯基化合物、硫乙醇酸盐
布朗诺醇(Bronopol)
光胱氨酸盐酸盐
季胺类化合物
卵磷脂+Lubrolw
卵磷脂(3%)+聚山梨醇80(3%)
洗必泰
甲醛
Lubrolw及卵磷脂
聚山梨醇80
铵离子
磺胺类化合物
对氨基苯甲酸
戊二醇
甘氨酸(3%)
卤素
硫代硫酸钠(0.1%)
介绍几种常见抑菌药物的中和灭活方法
1磺胺类药物:
于供试液中加入适量的对氨基苯甲酸,以保护菌体内二氢叶酸合成酶受磺胺的作用,继续合成二氢叶酸、核酸等必需物质,使待检细菌生长繁殖而得以检出
例1:
单一成分磺胺制剂(磺胺嘧啶片等):
加1%对氨基苯甲酸
具体方法:
按常规制备供试液,静置5min,取上层液10ml加入含1%对氨基苯甲酸0.5ml的100ml胆眼盐乳糖增菌培养基中,就能正常的检出大肠埃希氏杆菌
例2:
复方磺胺制剂(SMZ等):
加1%对氨基苯甲酸及联合其他方法
按常规方法制备1:
10供试液,静置5min,取上层液10ml置薄膜过滤器中减压过滤,以50ml灭菌胜利盐水冲洗滤膜三次,将滤膜置含有1%对氨基苯甲酸2ml的100ml增菌培养基中,可有效的检出大肠埃希氏杆菌
②含重金属药物制剂:
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