人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案样本Word文档格式.docx

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按

照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）

按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1~22号，性染色体用X和Y标记；

并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组用大写字母A~G表示。

染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。

根据这些特征，能够准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。

表1人染色体组型及其特征

组别

染色体序号

形态，大小

着丝点位置

次缢痕

随体

A

1~3

最大

中部着丝粒（1,

3）

亚中部着丝粒

（2）

1号染色体

B

4~5

次大

亚中部着丝粒

C

6~12X

中等

9号染色体

D

13~15

近端着丝粒

有

E

16~18

小

中部着丝粒

16号染色体

F

19~20

次小

G

21~22Y

最小

三、实验试剂与器材

试剂:

抗凝剂:

肝素溶液（500U/ml）;

培养基:

RPMI1640,按照说明书配制后抽滤、分装,冻存备用。

小牛血清：

市售，冰冻保存，用时在56C水浴条件灭活。

植物血球凝集素（PHA）:

市售,按说明书要求使用5%NaHC3O秋水仙素：

已有,1ug/ml,根据需要量取!

低渗溶液：

0.075mol/L氯化钾班上同意配制,我们组负责配!

Carnoy固定液

Giemsa染液：

磷酸缓冲液（pH6.8）10ml加Giemsa原液0.3ml,用时配制。

器材：

光学显微镜1台,离心机1台,恒温水浴箱1台,恒温箱1台,离心管17支,量简2个,烧杯2只,培养瓶2个,载玻片8张,玻片架2台,注射器4支,枪头2支,移液枪2支,胶塞2个,标签纸1圈,碘酒和酒精棉球,酒精灯,1台,天平1台,普通冰箱1台,立式染缸1个、染色架1个、镊子3个,直头小吸管14支、橡皮吸头14个、吸水纸若干,香柏油,擦镜纸,剪子1个，胶水。

正常人类染色体G带核型图，核型报告纸

四、实验方法

（一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）;

每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液,其中含：

RPMI16404ml

灭活小牛血清1ml

PHA2.5mg

依次将上述试剂加入培养瓶中,重复吹打使其混合均匀,用5%NaHG调节培养基的pH值至7.2-7.4。

（二）采血与培养:

先以碘酒和75%乙醇消毒皮肤。

用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml肝素,作静脉穿刺,抽取外周静脉血1ml。

转动针筒以混匀肝素

常规消毒后,立即将针头插入灭菌小瓶内,送入超净工作台,在火焰旁将血液滴入2〜3个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶

0.2〜0.3ml（6号针头45度倾斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。

贴好标签，将培养瓶放在37C恒温箱内静置培养

72h。

（每天摇动培养瓶一次）

（三）秋水仙素处理:

向经恒温培养68-72小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素，使其终浓度为0.4ug/ml,即每瓶（内装5ml培养基）中用6号针头倾斜45度角滴4滴,轻轻将液体摇匀,继续恒温培养3-4小时。

（四）标本的制备:

1、终止培养后,将培养物混匀,倒人离心管内,离心沉淀

10分钟（1000r/min）,弃去上清液。

2、加入37C预温的低渗液8m1,轻轻打匀，置37C水浴箱

中20分钟。

（使白细胞膨胀,染色体分散、红细胞解体。

）

3、低渗处理完毕后,直接加入新配的固定液1m1进行预固定,混匀后,离心10分钟（r/min）。

4、弃去上清液,沿离心管壁缓慢加入固定液4m1,轻轻吹打混匀,置室温15分钟。

5、

离心沉淀1000r/min,10

分钟。

6、

弃去上情液,再加入固定液

4m1吹打均匀重悬细胞,固定

10分钟。

7、

8、

重复固定一次。

9、

尽量吸净上清液,视管底剩下的细胞多少加入适量固定液

（0.3〜0.6m1）,轻轻吹打成细胞悬液。

10、滴片:

取保存在冰水中的冷湿载玻片1张,稍倾斜,用滴管吸取细胞悬液，从30~40cm高处滴2滴于玻片上，立即用口对

准玻片吹气,使细胞在玻片上散开,然后在酒精灯上略烘一下（勿全烘干,过火3-5次）,在空气中待干。

（四）染色:

1、

滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上

使片、板之间有一缝

隙,

将稀释后的Giemsa染色滴在片隙中

室温染色20分钟;

2、

自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面

）3〜5秒钟,晾干;

3、镜下观察染色体分带及染色情况

五、实验结果

1、观察自己制作的标本片中染色体的形态、颜色及其显带

情况,记录并说明原因。

计数10个细胞的染色体数。

2、试述染色体G显带技术在人类染色体识别中的意义。

3、绘出一套完整的中期分裂细胞的染色体图;

根据课堂提供的材料,排列初一份正常人类染色体G带

核型图。

4、实验报告

六、注意事项

（一）细胞培养技术

1、在体外模拟体内的生理环境,培养从机体中取出的细胞,并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。

由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能,因此在一切操作中要努力做到最大限度的无

菌,防止污染。

2、无菌操作的要领和要求

1）培养前准备为做好培养前用品的充分准备工作,根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品,清点无误后置于超净工作台内,这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。

2）超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟,然后关闭紫外灯打开风机,流入的空气是经过除菌板过滤的空气,工作台内可保持无菌环境。

为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射,消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。

3）洗手操作时因整个前臂要伸入超净工作台内,因此洗手时,一定要洗刷到肘部,然后用0.2%新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。

4）火焰消毒在超净工作台无菌环境中操作时,首先要点燃酒精灯,此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼,或在近火焰处进行。

注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。

烧过的用具都要待冷却后再接触细胞否则会烧焦形成炭膜,再用时会把有害物质带入培养液中。

5）操作进行培养操作时动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动增加污染机会。

不能用手触及器皿的消毒部分。

如已接触,要用火焰烧灼消毒或更换。

为拿取方便,工作台面上的用品要有合理布局。

原则上是右手使用方便的用品放在右侧,左手使用方便的用品放在左侧;

酒精灯置于中央。

培养液等不要过早开瓶,打开的培养液和培养用瓶等应保持斜位或平放,长时间开口直立,易增加落菌机会。

吸取各种用液时均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。

（二）染色体

染色体是生物细胞中的一个重要的组成部分,每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体。

染色体能经过细胞分裂而复

制。

而且在世代相传的过程中具有稳定地保持形态、结构和功能的特征。

染色体是遗传物质的载体。

人类99%的遗传物质位于染色

体上。

染色体数目、结构的改变将导致染色体病。

（三）操作

1、接种的血样越新鲜越好,最好是在采血后24h内培养,如不能马上培养，应置于4C冰箱存放，避免保存时间过久，以免影响细胞的活力。

培养过程中,如发现血样凝集,可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开，继续放回37C恒温箱内培养，最好每天轻轻震荡混匀一次。

2、Giemsa为噻嗪类染料，其碱性成份天青B与DNA分子中的磷酸基结合,蛋白质在一定的环境中,具有不同的嗜酸性和嗜硷性倾向，出现着色差异易于观察。

因此染液PH值对着色效果有影响。

当呈淡灰色带纹不显时,应调节染液pH值7.0~7.2,复染10min,可获得鲜亮的显色效果。

3、在采血接种培养是,不要加入太多的肝素。

肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转化和分裂。

但肝素量也不应太少,以免发生凝血或培养物中出现纤维蛋白形成的膜状结构。

这种膜状物一般在培养24小时左右出现,此时可在无菌条件下将它除去以免影响培养效果。

4、在普通培养箱内培养时,必须将培养瓶口盖紧,以免培养液的PH发生较大的变化。

如果培养过程中,培养液酸化比较严重

（培养液呈黄色时）将不利于细胞生长，此时可加入适量无菌的0.14%碳酸氢钠溶液调整或再加入2〜3ml培养液来校正。

培养箱的温度应控制在37C+0.5C,温度过高或过低都会影响细胞的生长。

5、染色体标本质量不佳的原因。

如果淋巴细胞转化试验表明培养

物生长发育良好，但制成的标本质量不佳时，其原因可能为：

⑴秋水仙素处理不当：

一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中