实验肿瘤药理学抗肿瘤药物的药效学评价PPT资料.ppt

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其形态特征等与人类肿瘤相似；

裸小鼠的应用使得实验结果更加接近临床实际；

易于大量繁殖并有可靠的质量保证。

9,1.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识,1.2.2肿瘤学基本知识1.2.2.1癌细胞的生物学特征：

癌细胞对于控制正常细胞增殖和分化的调节因素不能正常地发生反应，通常表现出持续性增殖和分化不良的倾向。

绝大多数恶性肿瘤（癌）细胞则丧失了接触性抑制这一生物学特性。

癌细胞表现出与邻近细胞及组织间关系的异常，改变了正常的组织结构形式，表现为浸润性生长和播散转移。

癌细胞能够把上述恶性特征遗传给它的下一代（子细胞）。

10,1.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识,1.2.2.2肿瘤细胞生长的特征肿瘤细胞的生长速度不是恒定不变的，通常为迅速生长和相对稳定状态相互交错出现。

大多数情况下其恶性程度逐渐增加。

恶性肿瘤组织增长的速度取决于三个因素，即细胞生长周期、增殖比例和细胞的丢失。

绝大多数肿瘤细胞的细胞周期时间短于肿瘤体积的倍增时间。

一般而言，实体瘤的细胞周期时间比其母体组织为长。

11,1.2实验动物模型与肿瘤学的基本知识,在肿瘤组织中，肿瘤细胞分为增殖细胞和不增殖细胞。

增殖细胞包括增殖能力有限的肿瘤细胞和增殖能力无限的肿瘤干细胞。

不增殖细胞包括G0期细胞和G1、G2期阻断细胞。

其中肿瘤干细胞和G0期细胞具有重要的生物学意义。

肿瘤的间质成分包括纤维母细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等。

一般而言，间质成分不断改变以适应肿瘤的生长。

肿瘤细胞能够产生肿瘤血管生成因子（TAF），TAF能够诱导新生的毛细血管生成，为快速增长的肿瘤组织提供营养，若阻断肿瘤毛细血管的生成，则肿瘤组织仅停留于直径23mm大小而无法增长。

12,1.3抗肿瘤药物研究的历史概要,1.3.1恶性肿瘤研究的历史1000多年前肿瘤的临床观察，分类与治疗。

1775年发现阴囊癌与接触煤焦油密切相关。

19世纪后半叶发现膀胱癌与苯胺染料接触相关，引起人们对化学致癌的关注。

1856年制定判断肿瘤细胞的标准。

1876年建立肿瘤的研究模型。

1900年成功的培育纯系动物，使得肿瘤学研究得以大踏步的向前迈进。

1908年发现鸡白血病。

1911年发现Rous肉瘤病毒，确定了病毒致癌的病因，该发现获得1966年诺贝尔奖。

1918年发现兔耳长期涂抹煤焦油诱发皮肤肿瘤。

1933年成功分离得到煤焦油中的致癌成分苯并芘，后又分离得到促癌成分佛波酯，化学致癌学说得以确立。

13,1.3抗肿瘤药物研究的历史概要,1969年癌基因假说提出。

1973年基因重组技术成功。

1975年第一个病毒癌基因Sre分离成功，并因此获得诺贝尔奖。

1981年从人的肿瘤中分离得到Ras癌基因，迄今为止已发现癌基因100多个）1986年第一个抗癌基因Rb被克隆。

1989年明确p53基因为抗癌基因。

（1983年发现以来一直没有定性；

该基因为目前已知的在恶性肿瘤中突变率最高的抗癌基因）。

1997年NCI开始执行“肿瘤基因索引计划（tumorgeneindexprogram,TGIP）”21世纪以来分子生物学技术高速发展加速了人们对肿瘤本质的认识，人们正在一步一步的揭开肿瘤神秘的面纱。

14,1.3抗肿瘤药物研究的历史概要,1.3.2抗肿瘤药物的研究肿瘤的药物治疗是肿瘤三大经典（即手术、化疗和放疗）治疗手段之一。

经典的化疗药物（细胞毒类药物及对肿瘤细胞具有直接杀伤作用的药物）的研究大致起步于20世纪三、四十年代。

15,1.3抗肿瘤药物研究的历史概要,具有重要意义肿瘤化疗药物的内容：

1946年研制成功烷化剂类抗肿瘤药物噻替哌、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥。

（耶鲁大学Glman等人，后于1958年德国研制成功另一个烷化剂环磷酰胺）1947年研制成功抗代谢药物甲氨喋呤、6-巯基嘌呤。

（HitchingsandElion，并以此而获得1998年诺贝尔医学奖，后又陆续研制成功5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷等）,16,1.3抗肿瘤药物研究的历史概要,1954年研制成功第一个抗生素类抗肿瘤药物放线菌素-D（Farber，亦称更生霉素，后又分别研制成功丝裂霉素、博来霉素、阿霉素等）1955年植物中分离得到第一个天然药物有效成分并使之成为抗肿瘤药物长春花碱和长春新碱。

（加拿大的Noble和美国Lilly公司的Johnson，后又研制成功三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、喜树碱、紫杉醇、VP-16等）1965年成功研制抗肿瘤药物顺铂。

（Rosenberg，后又研制成功卡铂等）,17,2.样品抗肿瘤活性的确证

（一）体内筛选实验,经典的体内、体外抗肿瘤实验是其它肿瘤学基础研究以及抗肿瘤药物作用机制研究的基础。

抗肿瘤药物体内筛选评价的基本原理是：

首先建立肿瘤的实验动物模型，在成功建立肿瘤动物模型的基础上，给以动物实验样品进行抗肿瘤治疗，最后通过观察治疗效果对药物的有效性、安全性以及作用特点做出正确的评价。

18,2.1概述,实验动物肿瘤模型根据获取肿瘤组织的不同，可以分为自发性肿瘤、诱发性肿瘤以及移植性肿瘤。

自发性肿瘤的特点是病程于人类肿瘤发生最为接近，发病年龄很大，发生率尽管很高，但是大多不能够达到百分之百。

小鼠常见高自发性肿瘤举例,19,2.1概述,诱发性肿瘤的因素主要包括化学因素（例如各种化学物质、毒素等）、物理因素（如放射线）和生物因素（如病毒）。

诱发肿瘤的方法包括口服法、注射法、涂抹法、植入法、辐照法等。

常见的动物诱发肿瘤模型举例,20,2.1概述,诱发肿瘤的特点是基本符合人类肿瘤发病的过程，造模时间较长，发病率接近100%，但是，肿瘤组织类型较为复杂（不单纯，各种组织类型或各部器官的肿瘤同时存在于一只动物体内或一群动物不同个体内）。

动物移植性肿瘤来自于自发或诱法的肿瘤，经过体内传代培育而成的实验动物肿瘤模型。

它的特点是肿瘤接种的成功率为100%，可在同一时间内获得大量生长均匀的肿瘤，肿瘤组织学类型单纯，接种肿瘤的动物成模时间短，可以在短时间内对药物的生物活性做出评价。

一般而言，药物抗肿瘤活性的筛选主要选择使用移植性肿瘤模型,21,2.2动物的选择及肿瘤接种,2.2.1动物的选择动物的选择中主要包括动物的种类、品系、体重、性别等。

（1）种类使用较多的是小鼠和大鼠，而小鼠的使用占有绝对的优势。

（2）品系根据肿瘤（瘤株）的不同选择不同品系的动物。

22,不同瘤株对实验动物品系的要求,23,2.2动物的选择及肿瘤接种,（3）体重小鼠的体重18至22克，具体实验时，体重最好控制在1克以内（实际工作中一般为1克）。

大鼠的体重应该在50至100克。

具体实验时，体重最好控制在5克之内（实际工作中一般为5克）。

（4）性别动物的性别一般没有特别的要求，某些特殊的肿瘤，例如乳腺癌、卵巢癌等则考虑使用雌性动物。

24,2.2动物的选择及肿瘤接种,2.2.2移植瘤的接种（肿瘤的移植）

（1）接种的一般要求。

在无菌条件下完成接种的实验操作。

肿瘤组织的污染往往是肿瘤接种失败的主要原因，所以应该特别引起注意。

（2）实体瘤瘤块的制备（瘤块接种法）。

7至10天的荷瘤动物，肿瘤生长及动物生长状况良好。

切取肿瘤组织，剪成2至3立方毫米的小块，塞入套管针中，接种于动物的右侧腋窝皮下，从肿瘤组织取出至接种完毕应该在30分钟内完成。

（3）瘤细胞悬液的制备（细胞悬液接种法）取出的肿瘤组织剪成小块，放入玻璃的组织匀浆器中，按照肿瘤组织（g）生理盐水（mL）=1314。

制备细胞悬液，按照0.2mL/只进行接种。

全部操作的时间控制在30分钟之内。

25,2.2动物的选择及肿瘤接种,（4）腹水型肿瘤细胞悬液的制备（腹水型瘤源接种法）主要操作包括抽取腹水。

细胞计数，载玻片推片，瑞氏或基姆萨染色，分类计数，要求肿瘤细胞数的比例不小于95%。

将腹水用生理盐水稀释10100倍，以拒染法计数活细胞的比例，要求活细胞数不少于95%。

接种，将稀释好的腹水细胞悬液接种于动物的腹腔（0.10.2mL/只）或接种于皮下（0.2mL/只），全部操作（取出腹水至肿瘤接种完毕）要求在60分钟内完成。

（5）白血病株的接种腹水型的白血病例如L1210和P388的接种方法与腹水型肿瘤的接种方法相同。

L615小鼠白血病的接种方法是：

摘取脾脏，制备组织匀浆；

细胞计数，将细胞浓度调整为4107个/mL；

接种，每只动物皮下接种细胞悬液0.10.2mL。

26,2.3移植性动物肿瘤的质量鉴定,

（1）每年进行一次实验动物瘤株的组织学检查。

（2）定期进行细菌培养检测，以鉴别污染情况。

（3）肿瘤生长潜力的检查。

27,下述情况判断为肿瘤生长不良：

实体瘤小鼠20%的肿瘤重量小于0.4克，或平均瘤重小于1克；

大鼠肿瘤平均重量小于2克。

腹水型肿瘤荷瘤动物生存期超出范围（不同肿瘤生存期不同）仍然存活；

经过一定的稀释接种之后无肿瘤生长。

（4）瘤株相容性的鉴别（5）死亡分析（5）阳性对照药品对肿瘤生长的作用考察动物移植肿瘤对临床常用化疗药物的敏感性，观察肿瘤细胞是否出现耐药。

28,附表：

临床常用化疗药物对动物移植肿瘤的敏感性,29,2.4待筛样品的制备,样品制备过程中应该注意的问题：

对于化学性能不稳定的样品一定要新鲜配置，对于化学性能是否稳定不清的样品应该按照不稳定来处理。

对于水溶性较差的样品应该采用某些助溶剂尽可能使其溶解成为真溶液，特别是给药途径为注射给药时。

灌胃给药者可以配制成混悬液。

选择溶解方法时应该考虑对机体不应产生不良反应。

在实验室中配置好的样品一般均为4（冰箱）保存。

生物制剂样品一般均需要低温保存，同时还要避免反复冻融，因此，样品配制过程中应该考虑进行适当的分装。

需要避光保存的样品因该使用棕色器皿。

30,2.5剂量的选择、动物分组及数量,2.5.1剂