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1)定方案:
首先要查阅资料,了解所需菌种的生长培养特性。
2)采样:
有针对性地采集样品,以采集土壤为主。
3)增殖:
人为地通过控制养分或培养条件,使所需菌种增殖培养后,在数量上占优势。
4)分离:
利用分离技术得到纯种。
5)发酵性能测定:
进行生产性能测定。
这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
2、采土方式:
在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。
为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。
3、采样注意事项
1)采样时应尽可能保持相对无菌;
2)所采集的样本必须具有某种代表性;
3)采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等;
4)应充分考虑采样的季节性和时间因素
,因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的
5)采好的样应及时处理,暂不能处理的也应贮存于4℃下,但贮存时间不宜过长。
这是因为一旦采样结束,试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境,其内部生态环境就会发生变化,微生物群体之间就会出现消长。
4、水样采集方法
1)用于细菌检测的水样应收集于100ml干净、灭菌的广口塑料或玻璃瓶中。
2)由于表层水中含有泥沙,故在采样时应在较深的静水层中采集水样。
3)方法是:
握住采样瓶底浸入水中30-50cm处,然后瓶口朝下打开瓶盖,让水样进入。
如果有急流存在的话,应直接将瓶口反向于急流。
采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。
水样不应装满采样瓶。
所有水样都应在24h之内迅速进行检测,或者4℃下贮存。
5、发酵工程所利用微生物的特点
1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力
2)有极强的消化能力
3)有极强的繁殖能力
6、发酵工程三要素
1)生产菌种的性能(即高产菌株);
2)科学的生产管理(包括补料发酵等);
3)先进的生产设备。
7、一般筛选菌种步骤如下
标本采集→材料预处理→富集→菌种分离初筛→性能测定→菌种的应用与保藏。
第三章优良菌株的选育
1、一个优良的生产菌株应具备以下的基本特性:
1)发酵周期短,代谢能力高:
在不增加生产投资的前提下能大幅度提高企业的产量;
2)附产物少:
发酵过程中,与目标产品近似的附产物少,这样既能提高转化率,又能减轻提取分离的难度;
3)繁殖能力强:
有较强的生长速率,产孢菌株应有较强的产孢子能力。
这样既能缩短生产周期,又可减少污染。
4)利用底物原料(如碳、氮源)广泛:
对原料波动的敏感性小,使发酵可用价兼,来源广泛的原料;
5)原料转化率高:
能高效地将原料转化为产品,以提高市场竞争力;
6)对添加的前体物质有耐受能力,不以该物为碳源利用;
7)在发酵过程中产生泡沫少,这样可提高发酵的装填系数,达到提高产量,降低成本的目的;
8)具有抗噬菌体感染能力;
9)遗传特性稳定,以减少复壮次数。
2、自然选育(spontaneous
mutation),自然选育是从自然界筛选非人工诱变产生的生产菌株。
一般认为自然界菌株变异由两种原因引起,即多因素低剂量的诱变效应和互变异构现象:
1)多因素低剂量诱变效应:
指低剂量的宇宙射线,各种短波辐射,低剂量的诱变物质作用引起的突变。
2)互变异构效应:
指DNA复制时,四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构而引起的碱基错配。
这种几率在自然界具统计在1x10。
3、自然变异的菌株会导致两种不同结果:
一是导致产品产量或质量下降;
二是对生产有益的突变。
因此生产上要经常进行菌种自然选育,从而淘汰退化的,选出优良的生产菌种。
自然选育是用平板稀释法,分离出单菌落,再测试菌种的生产能力,从而选出高水平菌株。
它是一种简单易行的选育方法,可以达到纯化菌种、防止退化,稳定生产,提高产量的目的。
自然选育效率较低,因此常与诱变育种交替使用,以提高育种效率。
4、诱变育种,利用物理化学或生物制剂等因素,使微生物的遗传物质发生变异导致物种的遗传性状改变,从而获得生产上的优良菌株的这类方法统称诱变育种。
诱变处理方法
物理法:
包括紫外线、X射线、r-射线,快中子、电场,磁场和激光等。
化学诱变剂:
如碱基类似物(2-氨基嘌呤,5-溴尿嘧啶8-氮鸟嘌呤);
与碱基反应的物质(硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、亚硝酸等);
在DNA分子中插入或缺失一个至多个碱基的物质(丫啶类物质、丫啶氮芥衍生物,用一定剂量及合理的使用方法处理出发菌,然后再通过测试,直至筛选出高产菌株。
)
生物诱变剂:
利用噬菌体、转座子将遗传物质DNA片断载入细胞,使其在复制过程中嵌入新的信息,由此获得高产菌株。
复合处理:
用两种以上的诱变剂先后处理菌株,实践证明复合处理要比单一处理突变率要高3—4倍,金色链霉菌的高产株就是用紫外和乙烯亚胺复合处理后筛选得到的。
5、突变类型
经诱变后的菌株有很多突变类型,主要分为形态突变型和生理突变型,二者也有相互联系。
1)形态突变型:
菌落形态变异、菌落大小、表面结构、边缘形状、颜色等发生变化;
菌丝形态变异:
菌丝粗细、曲、直,气生菌丝分枝,孢子丝形状等;
细胞及孢子形态变异:
细胞和孢子的形态大小产生变化。
2)生理突变
生产性能变异;
目的代谢物是否提高,副产物是否减少;
颜色与色素变异:
颜色是指营养细胞,菌丝及孢子的颜色,色素是指溶于基质中的色素,这些变化往往与生产性能相关;
发酵变异:
在培养过程中能否利用某些碳源或氮源,
营养缺陷型:
表现在生长过程中缺乏某一生长物质,如不能从外界补给便不能生长繁殖,这些缺陷型主要有氨基酸,维生素嘌呤和嘧啶等缺陷型;
抗性突变:
如抗噬菌体能力,抗高温,抗高渗透压等能力发生变化;
抗药性突变:
对某一药物或抗生素浓度的抗性增强或减弱,抗菌素的生产与药性有关。
6、杂交育种,通过有性生殖、准性生殖和细胞融合等方式,让两个表型差异较大的菌株之间的基因重组,使其亲本的优良性状组合到一起,得到提高产量和质量的新菌株,这种方法称为杂交育种。
1)准性生殖,一种类似于有性生殖但比有性生殖原始的一种繁殖方式。
其过程为:
质配→核配→单倍体化,不通过减数分裂而导致基因重组,为杂交育种提供了条件,该过程可分为三个阶段:
异核体的形成:
由不同性状的亲本菌丝相互吻合,形成一个细胞里含有两个不同遗传性状的细胞核;
杂合双倍体的产生:
在异核体的基础上,两个不同遗传性状的细胞核偶尔融合,出现具有杂合双倍体的细胞(多为菌丝体);
重组体形成:
杂合双倍体极不稳定,在进行有丝分裂过程中,极少数细胞发生染色体交换(体细胞交换)和单元化(即双倍体细胞经多次分裂转变为单倍体细胞)而产生重组体。
7、营养缺陷型:
菌株经诱变处理后其变异株在营养上表现出某些营养缺陷,故需在培养基中加入某些组分(即补充培养基)才能生长,可用基础培养基和补充培养基对照培养将其检出。
8、原养型:
能在两种营养缺陷型培养基上生长的重组型菌株;
9、野生型:
在发生变异之前的出发菌株。
10、基本培养基(MM):
能满足野生型和原养型生长的合成培养基,营养缺陷型菌株不能生长的培养基;
11、补充培养基(SM):
在MM里添加某些物质(如:
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等),使营养缺陷型菌株生长的培养基。
12、完全培养基(CM):
在基本培养里加入蛋白质,酵母膏等天然物质,可满足多种营养缺陷型菌株生长的培养基。
13、生产基因工程菌的主要程序:
克隆目的基因→构建DNA重组体→重组DNA导入宿住细胞→基因表达及工程菌的筛选
14、原核表达系统
1)大肠杆菌:
由于生长繁殖迅速,对该菌分子遗传学研究比较深入,以至目前它仍是基因工程中最常采用的原核表达系统。
大肠杆菌的表达形式多种多样,有细胞内不溶性表达(包含体)、胞内可溶性表达。
2)枯草芽孢杆菌:
该菌分泌能力强,可将蛋白产物直接分泌到胞外,不形成包含体,它也不能使蛋白质产生糖基化。
有很强的胞外蛋白质酶,能不同程度地降低产物,故在表达系统中受影响。
3)链霉菌;
重要的工业微生物,作为源基因表达系统有着不致病使用安全,分泌能力强,能将产物分泌到胞外,具有糖基化能力。
其中变铅青链霉菌限制能力弱,是一个理想受体菌,现已构建系列载体,培养工艺也比较成熟。
15、真核表达系统
1)酵母:
是研究基因表达调控最有效的单细胞生物,其基因组较小,仅为大肠杆菌的4倍,世代周期短,有单、双倍体两种形式,加之酵母生长繁殖快,易培育。
不产生毒素,基因工程操作方便,与原核生物相似,表达产物能糖基化,故被认为是真核蛋白质的最佳表达系统。
目前如干扰素,乙肝表面抗原基因等已在酵母中成功地表达。
2)丝状真菌
第四章菌种的退化复壮和保藏
1、退化现象
1)对产量性状来说,菌种的负变就是衰退。
2)其他原有的典型性状变得不典型时,也是衰退。
最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。
3)生长速度缓慢,产孢子越来越少。
4)代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。
5)衰退还表现在抗不良环境条件(抗噬菌体、抗低温等)能力的减弱等。
2、退化的原因
1)自发负突变:
在自然光照或微量诱变剂的刺激下发生的基因突变;
或经杂交育种的菌株性能不稳定而产生的回复突变,造成的菌株性能的负突变现象;
2)培养条件影响:
如温度时高时低,营养组分不稳定,PH,溶氧等因素不稳定都会导致菌种退化;
3)传代次数:
传代次数多也是菌种退化的原因之一。
3、防止退化的措施
1)防止基因自发突变
低温保藏菌种(0-4℃),使菌株处于休眠状态下较为稳定;
设置遗传障碍:
营养缺陷型菌株的回复是由于原来的遗传性障碍被解除,可给该类菌株设置回复障碍。
如:
给腺苷酸生产菌添加琥珀腺苷酸;
鸟苷酸生产菌添加黄嘌呤核苷酸等保护剂(或称诱变障碍)。
可使菌株的性能相对稳定。
2)防止退化细胞在群体中占优势
少传代:
一般情况下每传一代,霉菌,芽孢杆菌,放线菌在低温(0-4℃)下可保藏半年左右,酵母在三个月左右,可将以上菌种在一次性转接时多接一些斜面,以减少移植代数;
单细胞分离纯化:
定期的单细胞分离纯化也是防止退化的主要手段之一,即每次挑出性能优良的单菌落培养使用。
选择合适的培养条件:
根据各生产菌种的性能,保证其相适应的温度、PH、营养等最佳条件。
4、复壮的概念
1)狭义的复壮仅是一种消极的措施,它
指的是在菌种已发生衰退的情况下,通过纯种分离和测定生产性能等方
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