trizolLS试剂使用中文说明书Word下载.docx
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分离的蛋白质可以用于WesternBlots,recoveryofsomeenzymaticactivity,andsomeimmunoprecipitation.
注意:
TRIzolLS试剂适用于液体样品(如,血液和病毒制品)。
TRIzolLS试剂与TRIzol试剂仅在它们成分的含量上不同,TRIzolLS试剂的浓度更高,因此相对于同个样品时,TRIzolLS试剂需要量更少。
不要将未稀释的TRIzolLS试剂用于固体样品。
处理固体样品时,TRIzolLS试剂没有TRIzol试剂效果好,收率要低些。
警告
TRIzolLS试剂含有的成分具有毒、腐蚀性和刺激性,如果处理不慎会有危害健康。
请在通风橱里操作,并穿好实验服、戴好手套和安全眼镜。
避免直接接触TRIzolLS试剂,会导致皮肤、眼睛或者呼吸道等暴露部位的化学灼伤。
如果万一接触了皮肤或者眼睛,请立即用大量水冲洗15min,必要时去医院护理。
如果吸入了气体,立刻到通风地方呼吸新鲜空气,必要时去医院护理。
内容和贮存
TRIzolLS试剂有100ml和200ml两种规格的,室温运输和贮存。
妥善保管,1年内性质都很稳定。
使用目的
仅用于研究,不能用于人或动物的诊断或治疗。
需要材料
分离RNA、DNA和蛋白质还需要下列材料,但是我们未提供
分离RNA时,需要:
氯仿;
异丙醇;
75%乙醇(DEPC水处理过);
无RNase水或者0.5%SDS;
能达到12,000*g的高速离心机;
聚丙烯微量离心管;
水浴槽(55-60℃)。
分离DNA时,需要:
100%乙醇;
75%乙醇;
0.1M柠檬酸钠(10%乙醇);
8mMNaOH;
聚丙烯微量离心管。
分离蛋白质时,需要:
0.3M盐酸胍(95%乙醇);
1%SDS;
样品准备
样品均质化
1.确定样品类型,在室温下如下表操作。
TRIzolLS试剂与样品的体积比为3:
1,一定要按指定的量加入TRIzolLS试剂,否则提取RNA会有DNA污染。
当样品少量(<
106细胞或者<
10mg组织)或者样品体积<
0.25mL,为方便提取RNA,需用无RNase水调整样品体积到0.25ml。
样品类型为生物液体时,操作步骤:
1.每0.25ml样品加入0.75mlTRIzolLS试剂;
2.移液器上下吹匀几次,使样品均匀。
污染物质含量高的生物液体(如,全血)应该先用无RNase水按1:
1稀释。
样品类型为组织时,操作步骤:
1.每50-100mg组织样品或者0.25ml组织悬液加入0.75mlTRIzolLS试剂;
2.高速搅拌器混匀样品。
采集样品后要立即处理和冷冻组织样品,不能处理未稀释的固体样品。
样品类型为单层贴壁细胞时,操作步骤:
1.吸出培养皿中的培养液;
2.每10cm2表面积的培养皿加入0.3-0.4mlTRIzolLS试剂,直接加到培养皿里细胞上;
3.移液器上下吹匀几次,在培养皿里直接裂解细胞。
不要在培养皿中加水混匀,粘附在皿上的残留培养液足够了。
样品类型为悬浮细胞时,操作步骤:
1.离心去除培养液获得细胞;
2.每0.25ml样品(来自动植物或者酵母细胞5-10*106,或者细菌细胞1*107)加入0.75mlTRIzolLS试剂;
加入TRIzolLS试剂之前切忌洗涤细胞,避免增加mRNA降解机率;
3.移液器上下吹匀几次,裂解细胞,对于酵母或者细菌细胞,可能还需要高速搅拌器来充分裂解。
2.(可选)当样品里脂肪、蛋白、多糖或者胞外物质(如,肌肉、脂肪组织或者块茎植物等材料),需要再加个分离步骤,移除样品里难溶物质。
如果你还需要回收样品里DNA,就不能做此步。
具体步骤:
1.混匀样品(如前面步骤1所述)后,4℃下,12,000*g离心样品10min;
离心后沉淀物质包含ECM、多糖和高分子量的DNA,RNA在上清液里,若样品富含脂肪,在上清液上面还有脂肪层;
2.移除覆盖的脂肪层;
3.将澄清的上清液移到新的离心管中。
3.进行相分离,或者储存已混匀的样品。
此样品能在室温放置几个小时,或者在-60到-70℃至少一个月。
相分离
1.室温静置已混匀样品(见混匀样品步骤)5min。
2.每0.75mlTRIzolLS试剂加入0.2ml氯仿。
盖紧离心管的盖子。
3.使劲地手摇离心管15s。
4.室温静置2-15min。
5.4℃下,12,000*g离心样品15min。
混合物被分为3层,上层是澄清的水相,中间层,下层是红色的酚-氯仿相,只有RNA被排除在水相里。
上层水相体积约占TRIzolLS试剂最初体积的~70%。
6.倾斜离心管为45°
,小心地用移液器吸走水相,避免吸到中间层或者有机层。
7.将水相移到新的离心管,然后进行RNA分离步骤。
8.如果需要分离DNA和蛋白质,则保持中间层和酚-氯仿相有机层。
详见DNA分离步骤和蛋白质分离步骤。
有机相可在4℃保存过夜。
RNA分离步骤
当制备和处理RNA时,需要采取适当措施避免RNase污染。
RNA沉淀
1.(可选)当沉淀从少量样品(<
10mg组织)提取的RNA,需要添加5-10μg不含RNase的糖原作为水相的载体。
糖原是RNA的辅助沉淀剂,浓度≤4mg/ml时不会抑制第一链合成,也不会抑制PCR。
2.每0.75mlTRIzolLS试剂加入0.5ml100%异丙醇到水相。
3.室温静置10min。
4.4℃下,12,000*g离心10min。
离心前,RNA通常看不见,离心后,在离心管底部和侧面可见丝状沉淀物。
5.进行RNA洗涤和重悬
RNA洗涤和重悬
1.移走离心管里上清液,只留RNA沉淀。
2.每0.75mlTRIzolLS试剂加入1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀。
涡旋,混匀样品。
3.4℃下,7500*g离心5min,弃上清液。
4.真空或者空气干燥RNA沉淀5-10min,不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。
不要让RNA沉淀干燥太彻底,否则RNA沉淀溶解度降低,会使A260/280<
1.6。
5.用无RNase水或者0.5%SDS(20-50μL)重悬RNA沉淀,移液器上下轻轻吹溶液几次。
如果要用于随后的酶反应中,就不要将RNA溶解在0.5%SDS里。
6.在水浴槽55-60℃孵育10-15min。
7.继续下游操作或者储存在-70℃。
DNA分离步骤
从相分离步骤中保存的中间层和酚-氯仿层提取DNA。
DNA沉淀
1.移走覆盖在中间层上的残留水相层,这是涉及到DNA提取质量的关键一步。
2.每0.75mlTRIzolLS试剂加入0.3ml100%乙醇。
3.盖紧离心管,上下颠倒几次,混匀样品。
4.室温静置2-3min。
5.4℃,2000*g离心5min,沉淀DNA。
6.移走酚-氯仿层,如果需要提取蛋白质,则保留在新的离心管中。
该上清液可在-70℃下保存数月。
7.对DNA沉淀进行DNA洗涤和重悬。
DNA洗涤和重悬
1.每0.75mlTRIzolLS试剂加入1ml柠檬酸钠/乙醇溶液(10%乙醇溶有0.1M柠檬酸钠,PH8.5)。
2.室温静置30min,不定时轻轻地上下倒置混匀。
DNA能在柠檬酸钠/乙醇溶液里保存2h。
3.4℃,2000*g离心5min,弃上清液。
4.再次洗涤(重复步骤1-3)。
当DNA沉淀较多(>
200μg)时,重复洗涤两次。
5.每0.75mlTRIzolLS试剂加入1.5-2ml75%乙醇。
DNA样品在75%乙醇4℃能保存数月。
6.室温静置10-20min,不定时轻轻地上下倒置混匀。
7.4℃,2000*g离心5min,弃上清液。
8.真空或者空气干燥DNA沉淀5-10min,不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。
9.以0.2–0.3μg/μL浓度用8mMNaOH重悬DNA,每50-70mg组织或者1*107细胞加入8mMNaOH0.3-0.6mL。
我们高度建议用温和碱溶液重悬DNA,因为分离的DNA在水或者Tris缓冲液中重悬效果不好。
10.4℃,12,000*g离心10min,移走不溶物质。
11.将含DNA的上清液转移到新的离心管中,若需要,用HEPES调节PH,进行下游操作。
DNA能在4℃保存过夜,要想长期保存,则需用HEPES调节PH7-8,添加1mMEDTA,保存在4℃或者-20℃。
DNA和RNA产量测定
用RNA和DNA在260nm和280nm处的吸收值测定浓度。
预期产量
下表列出了各种来源材料提取RNA(A260/280>
1.8)和DNA(A260/280为1.6-1.8)的标准产量
蛋白分离步骤
从DNA沉淀步骤后留下来的酚-氯仿层分离蛋白质,蛋白质沉淀或者蛋白透析。
蛋白质沉淀
1.每1mlTRIzolLS试剂加入1.5ml异丙醇到酚-氯仿层。
2.室温静置10min。
3.4℃,12,000*g离心10min,保留沉淀的蛋白,弃上清液。
4.对蛋白沉淀进行蛋白洗涤。
蛋白洗涤
1.准备洗涤液,即:
0.3M盐酸胍溶于95%乙醇。
2.每1mlTRIzolLS试剂加入2ml洗涤液,洗涤蛋白沉淀。
3.室温静置20min。
蛋白样品可在0.3M盐酸胍-95%乙醇,4℃下保存一个月或者-20℃至少保存一年。
4.4℃,7500*g离心5min,弃洗涤液。
5.重复步骤2-4,两次。
6.洗涤3次后,加入2ml100%乙醇,涡旋。
7.室温静置20min。
8.4℃,7500*g离心5min,弃乙醇洗涤液。
9.空气干燥蛋白沉淀5-10min,不要干燥太彻底。
10.进行蛋白重悬步骤。
蛋白重悬
1.加1%SDS200μL,用移液管上下吹打直到蛋白重悬。
为了彻底溶液蛋白沉淀,可能需要将蛋白沉淀在水浴槽50℃孵育。
2.4℃,10,000*g离心10min,让不溶物质沉淀。
3.将含有蛋白
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