荧光分光度法PPT文件格式下载.ppt
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荧光光谱分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性,以荧光强度进行定量的一种分析方法。
三、荧光光谱分析法的特点,1.灵敏度高荧光强度随激发光强度增强而增强(提高激发光强度,可提高荧光强度)。
采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度,荧光分析法的检测限比分光光度法低24个数量级,荧光10-7-10-9紫外10-4-10-7mg/mL,三、荧光光谱分析法的特点,2.选择性好不同的物质用不同的光进行激发,选择不同的激发光波长不同的物质发射的荧光不同,选择不同的检测荧光波长比较容易排除其它物质的干扰,选择性好,3.实验方法简单4.待测样品用量少5.仪器价格适中,2-2荧光光谱法,一、荧光光谱基本原理二、荧光分析仪器三、激发光谱与发射光谱四、溶液荧光光谱的特征五、荧光物质的必要条件六、影响物质发光的因素七、定量分析方法八、荧光分析法的应用,具有不饱和基团的基态分子光照后,价电子跃迁基态分子价电子跃迁到激发态,光照激发,去激发光*n,基态,在光致激发和去激发光的过程中,分子中的价电子(、n电子)处于不同的自旋状态,通常用电子自旋状态的多重性来描述,一、荧光光谱基本原理,荧光涉及吸收和发射两个过程,在同一轨道上成对电子相反方向自旋更稳定分立轨道上非成对电子平行自旋更稳定,
(一)电子自旋状态的多重性,
(一)电子自旋状态的多重性,大多数分子含有偶数电子,基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的,处于基态单重态。
用“S0”表示;
当物质受光照射时,基态分子吸收光能产生电子能级跃迁,由基态跃迁至更高的单重态,电子自旋方向没有改变,净自旋=0。
S0,S*1,S*2,S*3分别代表基态,第一,二,三激发单重态,激发态的平均寿命约为10-8S,若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变,由基态单重态激发三重态,净自旋0。
这种跃迁为禁阻跃迁T*1、T*2、T*3分别表示第一、二、三激发三重态,自旋平行,激发态的平均寿命约为10-410S,分子内的激发和去激化过程,
(二)荧光、磷光的产生的机制,当处于基态单线态(S0)的分子吸收波长为1和2的辐射后,分别被激发到第一激发单线态(S1*)和第二激发单线态(S2*)的任意振动能级上,而后发生以下过程:
分子内的激发和去激化过程,振动弛豫VR:
处于激发态的分子,其电子跃迁到第一激发态(S*1)或更高激发态的不同振动轨道上,分子可以从这些能态以非辐射形式放出能量而到达同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动驰豫,时间约为10-12s数量级。
分子内的激发和去激化过程,内部转换ic:
当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时,如第一激发单线态的较高振动能级与第二激发单线态S*2的某一较低振动能级的位能相同,可发生电子由高能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上。
此过程效率高,速度快,一般只需10-13-10-11s。
分子内的激发和去激化过程,荧光发射:
处于激发单线态的最低振动能级S*1的分子,也存在几种可能的去激化过程。
若以10-9-10-7s左右的时间发射光量子回到基态S0的各振动能级,这时分子发射的光量子即称为荧光。
分子内的激发和去激化过程,外部转化ex:
部分激发态分子在分子间、分子与溶剂分子间或与其他分子间相互碰撞而失去能量,回到基态。
这是一种热平衡过程,属无辐射跃迁。
这一过程约需10-910-7s。
分子内的激发和去激化过程,系间窜越isc:
如果第一激发单线态S*1的较低振动能级同三线态T*1的较高振动能级重叠,即有了电子自旋反转发生的可能性;
电子由单线态S*1以无辐射跃迁的方式到三线态T*1的过程称为系间窜越,约需10-610-2s。
分子内的激发和去激化过程,磷光发射:
经过系间窜越的分子再通过振动驰豫降至三线态的最低振动能级,然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级,这种光辐射称为磷光。
这一过程约需10-410s。
分子内的激发和去激化过程,激发态能量的跃迁与转化的形式和速率:
A1,A2吸收:
VR振动弛豫:
10-12sic内部转化:
10-11sF荧光:
10-910-7sex外部转化:
10-910-7s(熄灭现象)isc系间窜越:
10-610-2sP磷光:
10-4100s,分子中电子受激跃迁到激发态后,处于激发态的分子是不稳定的,去激返回到较低激发态或基态时有两种方式:
无辐射去激和辐射去激。
无辐射去激不伴随发光现象的过程叫无辐射去激,体系内的多余的能量以热的形式释放。
包括:
内部转换(IC)相同的多重态之间的转换S-S系间窜跃(ISC)不同的多重态之间的转换S-T振动驰豫(VR)同一电子能级中,从较高振动能级到较低振动能级的过程外部转移(EX)指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移,使荧光或磷光强度减弱或消灭发生系间窜跃电子需转向,S1T1间进行,比内部转换困难,辐射去激伴随发光现象的过程叫辐射去激。
荧光激发态分子从第一激发单线态S*1的最低振动能级回到基态S0所发出的辐射。
荧光是相同多重态间的允许跃迁,产生速度快,10-910-7s,又叫快速荧光或瞬时荧光,外部光源停止照射,荧光马上熄灭。
无论开始电子被激发至什么高能级,它都经过无辐射去激消耗能量后到S*1的最低振动能级,发射荧光,荧光波长比激发光波长长。
荧激,辐射去激伴随发光现象的过程叫辐射去激。
磷光当受激电子降到S*1的最低振动能级后,未发射荧光,而是经过系间窜跃到T*1振动能级,经振动驰豫到T*1最低振动能级,从T*1最低振动能级回到基态的各个振动能级所发射的光叫磷光。
从T*1S0要改变电子自旋,发光速度慢,约为10-410s,光照停止后,磷光仍可持续一段时间。
分子相互碰撞的无辐射能量损耗大,所以磷光的波长更长:
磷荧激*易产生荧光n*易产生磷光,注意:
实现内部转换a、S*1S*2电子能级差小,易实现b、S*1S*2振动能级有位能交叉面体系间窜越的必要条件a、S*1T*1振动能级有位能交叉面b、微观磁场的微扰存在,外部转化使发光熄灭现象,T*1S0较S*1S0可能性大去激化众多过程中,以速度最快、激发寿命最短的途径占优势,相互竞争,荧光分析仪器主要由光源、单色器、样品池、检测器和显示器组成,光源,第一单色器,样品池,检测器,第二单色器,检测器,放大器及记录器,ex,em,与紫外分光光度计有两点不同两个单色器检测器与激发光互成直角,I0,I,二、荧光分析仪器,荧光仪器的光路示意图,二、荧光分析仪器,1、光源,激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度;
适用波长范围宽荧光计中,常使用高压汞灯作光源荧光光度计中常用氙弧灯,利用汞蒸气放电发光的光源;
常用其发射365nm、405nm、436nm三条谱线以365nm的谱线最强,应用最广泛的一种光源,可发射250800nm很强的连续光源,2、单色器,荧光计用滤光片作单色器,荧光计只能用于定量分析,不能获得光谱大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器,有较高的分辨率,能扫描图谱,既可获得激发光谱,又可获得荧光光谱第一单色器作用:
分离出所需要的激发光,选择最佳激发波长ex,用此激发光激发样品池内的荧光物质ex第二单色器作用:
滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光,用来选择测定用的荧光波长em。
在选定的em下测定荧光强度,定量分析,3、样品池,盛放测定溶液,通常是石英材料的方形池,四面都透光,只能用手拿棱或最上边4、检测器把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱,要求检测器有较高的灵敏度,荧光光度计采用光电倍增管荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度,是因为荧光强度与激发光强度成正比,提高激发光强度可大大提高荧光强度5、读出装置记录仪记录或打印机打印出结果,扫描激发光谱和发射光谱,磷光分析仪器,与荧光分析仪器相似,主要差异如下:
1.试样室试样需在液氮温度(77K,-196)下测定低温磷光(将样品池放在盛放液氮的杜瓦瓶内)固体表面室温磷光分析需特制试样室2.磷光镜有些物质既可产生荧光,又能产生磷光。
用机械切光装置磷光镜区别荧光和磷光。
利用荧光寿命短,磷光寿命长消除荧光干扰。
三、激发光谱与发射光谱,罗丹明B激发光谱,罗丹明B发射光谱,罗丹明B激发和发射光谱,三、激发光谱与发射光谱,硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱,任何荧光物质都具有两个特征光谱,即激发光谱和荧光光谱。
激发光谱:
是指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光所得的光谱。
获得方法:
先把第二单色器的波长固定,使测定的em不变,改变第一单色器波长,从200700nm扫描,让不同波长的光照在荧光物质上,测定它的荧光强度。
以激发波长(ex)为横坐标,荧光强度(F)为纵坐标作图,便可得到荧光物质的激发光谱。
固定em荧光波长,从曲线上找出ex,实际上选波长较长的高波长峰,三、激发光谱与发射光谱,硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱,发射光谱(荧光光谱):
固定激发光波长和强度,测定荧光波长与荧光强度的变化所得的光谱。
先把第一单色器的波长固定,使激发的ex不变,改变第二单色器波长,让不同波长的光扫描,测定它的发光强度(F),以F为纵坐标,em为横坐标得右图,即荧光物质的发射光谱。
固定ex激发光波长,从曲线上找出最大的em,注意:
荧光物质的最大激发光波长和最大荧光波长是鉴定物质的依据,也是定量测定时最灵敏的光谱条件。
实际测得的荧光光谱和激发光谱随仪器而异,其真实光谱必须要对光源、单色器、检测器的光谱特性加以校正。
真实的激发光谱与紫外吸收光谱非常近似,而不是相同。
四、溶液荧光光谱的特征,斯托克斯位移:
荧光激发光;
原因:
溶剂化效应非辐射损失,荧光光谱与激发光波长无关,原因?
荧光光谱与激发光谱呈镜像对称关系,原因?
荧光光谱与激发光光波长无关,原因?
如硫酸奎宁的激发光谱有两个峰,而对应的荧光光谱仅一个峰。
这是因为物质分子可以从基态跃迁至第一电子激发态S1*或第二电子激发态,因此激发光谱有两个峰。
但不管分子跃迁至S1*或S2*,都会经过无辐射跃迁下降至S1*的最低振动能级,再跃迁至基态的各个不同振动能级,同时发出荧光。
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱,因此,当荧光物质的激发光光谱有两个峰时,不管用哪一个峰的波长作激以光,也就是说不管分子跃迁至S1*和S2*,荧光的发生总是从的最低振动能级开始,荧光光谱只有一个峰。
蒽的激发光谱和荧光光谱,A1,A2,B,a,a,a,a,b,b,b,b,b,荧光形成机制,单重态,第二激发态,第一激发态,三重态,荧光,内转换,体系跨越,振动弛豫,基态,S1与S0振动能级相似,物质需有强的紫外吸收:
物质只有吸收了紫外-可见光,产生*n*跃迁,产生荧光。
*与n*跃迁相比,摩尔吸收系数大102103,寿命短,*跃迁常产生较强的荧光,n*跃迁产生的荧光弱,但可产生系间窜跃,产生
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