ndr2基因在肺腺癌细胞GLC82中的诱导表达Word文档格式.docx

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ndr2基因;

细胞转染;

表达

摘要:

目的构建蜕皮素诱导的抑癌基因ndr2哺乳动物真核表达载体（pIND-ndr2），转染肺腺癌细胞GLC-82，观看ndr2基因表达，为进一步研究ndr2的生物学功能打下基础.方式以RT-PCR方式确信正常人肺组织和肺腺癌GLC-82细胞ndr2的表达高低.PCR方式扩增ndr2，以BamHI+EcoRI双酶切连接入pUC19载体中，测序正确后，插入到蜕皮素诱导的真核表达载体pIND中.连有ndr2基因的载体（pIND-ndr2）用脂质体方式转染到培育的肺腺癌细胞GLC-82中.经G418和zeocin双抗生素挑选后，挑取单克隆进行培育，用蜕皮素诱导ndr2表达，用RT-PCR，western印迹和免疫组织化学方式验证取得表达的细胞株.结果PCR的方式扩增取得大小约1200bp的片段，连接入预先插入HA-tag的pUC19载体的ndr2基因经HindⅢ+EcoRI酶切后，构建到真核表达载体pIND中，酶切鉴定后证明连接片段正确.通过双载体转染和双抗生素挑选后，培育的细胞经诱导后检测到实验组ndr2的高表达，而对照组和未诱导的实验组ndr2表达均较低.结论ndr2基因成功转染培育的肺腺癌GLC-82细胞，成立了ndr2的可诱导表达的细胞系.

Keywords:

ndr2gene;

celltransfection;

expression

　　Abstract:

AIMToConstructionarecombinantpIND-ndr2expressionvector，toobserveitssteadyexpressionintrans-fectedhumanlungadenocarcinomacelllineGLC-82anditsroleinfurtherstudyofbiologicalfunctionofndr2forlungndr2geneofhumannormallungtissueandhumanlungadenocarcinomacelllineGLC-82wasamplifiedbyamplificationwasperformedbyusingprimersbasedontheknowngenesequenceofndr2，andfragmentsofDNAwasclonedintovectorsequenceofthefusiongenewasmammalianexpressionsystemwasrecombinantpIND-ndr2vectorwasconstructedatitsHindⅢ+EcoRIrecombinantpIND-ndr2vectorandpINDvectorweretranfectedintoGLC-82cellsrespectively，andthecellcloneswerescreenedwithG418andofndr2genewasdetectedbyRT-PCR，andexpressionofndr2proteinwasdetectedbywesternblotandimmunohis-tochemicalmethodafterthecellswereinducedwithponas-teroneThesequenceofndr2genethatwasclonedintovectorpUC19waswascor-rectlytransfectedintoGLC-82cellsandwasappropriatelyexpressedwithinductionofpanosteroneexpressionofndr2oflungadenocarcinomacellGLC-82transfectedbypIND-ndr2withinductionofpanosteroneAwasRecombinantpIND-ndr2expressionvectorwassuccessfullyconstructedandexpressedsteadilyinhumanlungadenocarcinomacelllineGLC-82.

　　0引言

　　ndr2基因是1999年从正常人全脑cDNA文库中克隆到的新基因［GenBank登录号AF-159092.］［1］，染色体定位于，基因组中由15个内含子，16个外显子组成.ndr2的cDNA全长2024bp.编码357个氨基酸的蛋白质，Mr约41×

103.目前研究说明，ndr2基因多种肿瘤组织或细胞系如肺癌、结肠癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和腮腺癌中无表达或低表达，相反在上述肿瘤相应的正常组织细胞中有较高水平的表达.另外在中枢神经系统的大脑皮质、白质、神经核，唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞中高表达.同时基因转染实验说明，ndr2可抑制胶质瘤BT325细胞由G1期向S期的过渡，因此，推测ndr2可能是一种新的抑癌基因.基因转染是研究基因功能的重要方式［2］.蜕皮素诱导的哺乳动物稳固转染系统是通过双载体转染，只有在蜕皮素诱导后才能使转染基因取得表达，从而能够操纵转染基因的表达.现利用蜕皮素诱导的哺乳动物真核表达载体，成立ndr2基因转染肺腺癌GLC-82细胞，为进一步研究ndr2在肺腺癌中的生物学特性奠定了基础.

　　1材料和方式

　　材料肺腺癌GLC-82细胞株由本校西京医院查验科临床分子生物学实验室提供.各类限制性内切酶和G418购自华丽生物工程公司.PCR反映系统（TaqDNA聚合酶、dNTP，10×

PCR缓冲液）、RNA酶抑制剂购自宝泰克公司，哺乳动物真核表达载体（pIND载体、pV载体）、蜕皮素panosteroneA和抗生素zeocin购自Invitrogen公司，RPMI1640培育基和Trizol购自Gibco公司，反转录酶AMV购自Promega公司.

　　方式

　　引物设计设计的引物序列为:

5′CGGGATCCATGGCGGAGCTGCAGGAGGTG3′，5′CGGAATTCAACAAGGGCCATTCAACAGGAGAC3′;

其中5′端引物引入BamHI的酶切位点，3′端引物引入EcoRI的酶切位点.

　　目的基因片段的扩增与克隆常规方式做PCR扩增，以人脑cDNA为模板，94℃预变性30s后，加入TaqDNA聚合酶.按94℃5s，72℃4min进行5个循环，94℃5s，70℃4min进行5个循环，94℃5s，68℃4min进行25个循环，另加72℃120s延伸.产物经胶回收后，以BamHI+EcoRI双酶切目的片段后定向插入预先插入HA-tag的pUC19载体中.重组后的质粒经转化扩增后，以BamHI+EcoRI双酶切鉴定，假设有与预期基因片段大小相近的片段切下那么为阳性.基因序列测定由上海基康公司进行.

　　真核表达载体pIND的构建与转染将测序后的载体pUC19-ndr2以HindⅢ+EcoRI消化，切下的片段插入到蜕皮素诱导表达pIND空载体中，转化感受态细胞JM109，摇菌后用上海华舜质粒提取试剂盒提取质粒，以HindⅢ+EcoRI酶切鉴定.将人肺腺癌GLC-82细胞接种于RPMI1640培育基（含100mL&

#12539;

L-1的胎牛血清），于37℃，50mL&

L-1的CO2条件下培育.将酶切鉴定正确的重组载体pIND-ndr2，pV和脂质体lipofectin共转染培育的肺腺癌GLC-82细胞.以空载体（pIND）、pV和脂质体转染做对照.

　　细胞株的挑选转染后48h，换RPMI1640培育基（含100mL&

L-1的胎牛血清），同时加入G418（终浓度500mg&

L-1）和zeocin（终浓度500mg&

L-1）进行挑选.2wk后挑取单个集落进行传代培育.

　　RT-PCR挑选表达ndr2的细胞株经上述的抗生素挑选后，挑选单克隆并扩大培育.别离搜集蜕皮素诱导72h和未诱导的ndr2转染GLC-82细胞及空载体转染细胞.加入1mLTrizol，冰浴条件下用注射器反复吹打，液体倒入试管中，加入氯仿，静置15min，4℃离心，12000g，15min，取上清加入异丙醇，静置20min，4℃离心，12000g，10min.沉淀重悬于75mL&

L-1乙醇，4℃离心7500g，5min，将其溶于DEPC处置水中，紫外分光光度计定量.取1μg模板加入1μLoli-godT，70℃，5min，迅速置于冰中，加入AMV5×

buffer5μL，10mmol&

L-1dNTP1μL，RNA酶抑制剂1μL，AMVRT反转录酶1μL，加DEPC处置水至25μL，42℃60min.即得鉴定ndr2基因的表达，条件为94℃预变性30s后，加入TaqDNA聚合酶.按94℃5s，72℃4min进行5个循环，94℃5s，70℃4min进行5个循环，94℃5s，68℃4min进行25个循环，另加72℃7min延伸.

　　Westernblot鉴定表达ndr2的细胞株培育ndr2转染肺腺癌GLC-82细胞及空载体转染细胞，通过15μL蜕皮素（1mmol&

L-1）诱导72h，搜集细胞约1×

107，加入的NP-40细胞裂解液（含10g&

L-1NP-40，20mmol&

L-1Tris-Cl，，150mmol&

L-1NaCl，&

L

-1NaN3，100mmol&

L-1CaCl2，用前加入&

L-1PMSF）.离心（14000g，4℃，10min），取上清常规方式做SDS-PAGE，转移到PVDF膜上，加入ndr2单抗，孵育后，洗涤.按检测试剂盒ECL（为Amer-sham公司的化学发光试剂）的说明进行，于暗室条件下压X-光片，感光10min.

　　免疫组织化学鉴定ndr2细胞内转染培育ndr2转染肺腺癌GLC-82细胞及空载体转染细胞，通过15μL蜕皮素（1mmoL&

L-1）诱导72h，将所培育的细胞胰酶消化，加入盖玻片上孵育24h，PBS洗3次，用40g&

L-1的多聚甲醛固定30min，PBS洗3次，37℃4h晾干，100mL&

L-1双氧水封锁30min，蒸馏水洗3次，3mL&

L-1TritonX-100打孔15min，PBS洗3次，正常羊血清封锁30min，加入ndr2鼠单抗，4℃留宿，PBS洗3次，每次10min，加入抗鼠二抗，60min，PBS洗3次，加入SABC，30min，PBS洗4次，DAB显色.

　　2结果

　　含ndr2基因的pUC19重组质粒酶切鉴定以PCR方式取得的ndr2基因经BamHI+EcoRI双酶切后，连接入预先插入的HA-tag的pUC19载体，命名为pUC19-ndr2.重组质粒再经BamHI+EcoRI双酶切后，取得大小约1200bp的酶切片段（Fig1）.基因序