饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMAPCR法文档格式.docx
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3、编制依据
主要依据以下标准:
NY/T1902饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验,GB4789.30食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB19489实验室生物安全通用要求,GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。
三、编制过程
标准的编制过程分三个阶段进行:
第一阶段:
单核细胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCF检测方法
的建立
1.引物设计
根据单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌Hly
基因序列设计一对特异性引物。
根据该基因中的保守且特异性序列,设计扩增271bp大小的特异性引物对。
表1引物序列
引物序列
片段大小
上游「
5'
-GATGACGAAATGGCTTACAGTGAAT-3'
271bp
下游
-CCACACTTGAGATATATGCAGGAGG-3'
2.EMA-PCR方法参数的优化
首先是探索单核细胞增生李斯特氏菌培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度,分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理,再分别加入EMA制备成EMA终浓度成梯度
变化的菌悬液,采用卤素灯进行光照交联。
然后通过离心收集上清液,进行PCF扩增,观察凝胶电泳结果,选出最优的致死方法和最佳EMA添加终浓度。
其次是最佳曝光时间的确定,在上述试验的结果上,选出最优组合,采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、810min,离
心收集上清液,进行PCR扩增。
3.确定方法的灵敏度和特异性。
4.用建立的单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCR方法检测饲
料及饲料原料样品,并与NY/T1902-2010饲料中单核细胞增生
李斯特氏菌的微生物学检验比对,以验证该方法的实用性和准确性。
第二阶段:
单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PCRi测方法应用
实验
本阶段主要进行单核细胞增生李斯特氏菌EMA-PC检测方法
在河南省范围内的应用实验。
为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性,由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用试验。
共对来自全国4个省(大部分样品来自河南
省)共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测;
共检测出1
批单核细胞增生李斯特氏菌阳性样品,并对单核细胞增生李斯特氏菌进行了分离鉴定。
同时与NY/T1902-2010《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验》进行了对比,检测结果显示,EMA-PC方法检测结果与传统培养法NY/T1902-2010检测结果完
全一致,但检测时间比传统培养法缩短了2-3天的时间。
通过对比发现,EMA-PCR方法具有准确、快速的特点,在应用推广方面具有一定的优势。
第三阶段:
标准的起草、修改与制定
根据以上实验资料及所有参与实验人员意见,在系统统计、
规定
科学分析的基础上,组织有关专家起草了《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法》河南省地方标准草案,了适用范围、样品处理方法、实验操作方法、结果判定等,并将标准草案送微生物有关方面专家征求意见,按照专家意见对标准草案进行多次修改完善,制定了当前的《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法(草案)》。
项目主持人:
吴志明,河南省兽药饲料监察所,主持本项地方标准的制定与编写。
主要起草人:
高延玲:
河南省兽药饲料监察所,负责标准的制定和技术推广。
方忠意:
河南省兽药饲料监察所,负责标准的制定和检测方法的优化。
董鹏:
河南省兽药饲料监察所,负责标准的制定、校订和检测方法的建立。
李金磊:
河南省兽药饲料监察所,负责标准的制定、校订和检测方法的建立。
狄元冉:
河南省兽药饲料监察所,负责标准的制定、校订和优化。
四、主要内容的确定
1.检测方法基本原理
EMA能够穿过死细菌的细胞膜,在强光照射下可与其基因组
DNA发生不可逆转的结合,使死细菌和游离状态的DNA不能作为
模板进行PCRT增。
根据单核细胞增生李斯特氏菌溶血素蛋白的基因Hly序列设计一对特异性引物,通过对样品进行EMA处理然
后进行PCR扩增及凝胶电泳分析,含单增李斯特菌活菌的样品会在271bp处出现一条目的条带,而含有单增李斯特菌死菌DNA及非单增李斯特菌的样品不会出现该条带。
2.最佳致死方法、EMA浓度及曝光时间
向煮沸致死、紫外处理和异丙醇处理后的0.5麦氏单位
(MCF单增李斯特菌菌悬液中分别加入EMA使其终浓度分别为
0、0.2、0.5、1、2、4、8卩g/mL,PCR结果电泳图分别为图1,图2,图3。
由图可以看出煮沸法致死效果最理想,加入EMA终
浓度为0.5卩g/mL既能完全抑制0.5MCF单增李斯特菌死菌的扩增。
另向0.5MCF活菌菌悬液加入EMA使其终浓度分别为0、1、2、4、6、8、10、12、14、16卩g/mL,PCR电泳结果如图4。
由图4可以看出加入终浓度为4卩g/mL的EMA样品PCR电泳条仍无明显减弱,表明终浓度低于4卩g/mL的EMA不会抑制单增
李斯特菌活菌的扩增。
图1煮沸处理
注:
MMarker;
1:
阴性对照;
2:
0卩g/mLEMA3:
0.2卩g/mLEMA4:
0.5卩g/mLEMA5:
1卩g/mLEMA6:
2卩g/mLEMA7:
4卩g/mLEMA8:
4卩g/mL
EMA
图2紫外照射处理
2:
0卩g/mLEMA3:
0.5卩
g/mLEMA5:
1卩g/mLEMA6:
4卩
g/mLEMA
图4EMA抑制单核细胞增生李斯特氏菌活菌浓度
MMarker;
0卩g/mLEMA;
3:
1卩g/mLEMA4:
2卩g/mL
EMA5:
4卩g/mLEMA6:
8卩g/mLEMA7:
10卩g/mLEMA8:
12卩g/mLEMA
9:
14卩g/mLEMA10:
16卩g/mLEMA
将煮沸致死的0.5MCF单增李斯特菌菌悬液,加入EMA终浓
度为0.5卩g/mL,黑暗环境下孵育5min后,分别曝光0、1、2、
4、6、8、10min,处理后PCR产物电泳结果如图5所示。
由图5
可以看出只有不曝光的有条带,其他均无条带,说明EMA处理后,
曝光1min,即可使EMA与死菌充分交联。
bp
2000——
1000—
750—
500—
250—
100—
M12345678
图5曝光时间
MMarker;
0min;
1min;
3:
2min;
4:
4min;
5:
6min;
6:
8min;
7:
10min;
8:
阴性对照
3.PCR方法的灵敏度
用灭菌棉签蘸取新鲜培养的营养琼脂固体平板上的单增李
斯特菌菌落转接于5mL灭菌去离子水中,用比浊仪调至0.5MCF系列稀释至10-1-10-8,以此为模板,按上述方法进行EMA-PC忒验,同时对检出的最低稀释度进行涂板计数,每个稀释度做3个
重复,37C培养24h,检测PCR反应灵敏度。
结果表明,建立
的PCR方法检测最底线是1.3x102cfu/mL(图6)。
图6PCR灵敏度检测
108CFU;
107CFU4:
106CFU5:
105CFU
6:
104CFU7:
103CFU8:
102CFU9:
10CFU;
10:
1CFU
4.PCR方法的特异性
将单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株及其余待测菌株单菌
落分别接种于LB肉汤中过夜培养,取菌液作为PCR反应模板,
按上述方法进行试验。
结果如图7,由图可以看出以单增李斯特
菌菌株为模板的PCR产物出现有1条特异性的271bp条带,与预测序列片段大小相符;
阴性对照、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、
大肠杆菌等10株非李斯特氏菌及格氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌等5株非单增李斯特菌
菌株未出现任何扩增条带;
同时也未发现有其他非特异性扩增条带,表明建立的PCR方法具有很高的特异性。
图7PCR特异性
单核细胞增生李斯特氏菌;
2:
3:
斯氏李斯特氏菌;
4:
伊氏李斯特氏菌;
5:
威氏李斯特氏菌;
格氏李斯特氏菌;
7:
英诺克李斯特氏菌;
&
福氏志贺氏菌;
宋内氏志贺氏菌;
10:
鲍氏志贺氏菌;
11:
金黄色葡萄球菌;
12:
大肠杆菌;
13:
肠产毒性大肠杆菌;
14:
肠致病性大肠杆菌;
15:
鼠伤寒沙门氏菌:
16:
肠炎沙门氏菌17:
甲型副伤寒沙门氏菌
5.结果报告
凡被检样品的PCR扩增产物电泳结果在271bp处出现一条目的条带(见图8),即可报告该样品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。
2000'
—
1000
7S0—
图8
- 配套讲稿:
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- 饲料 单核 细胞 增生 李斯特 氏菌活菌 检测 EMAPCR