流式细胞术免疫标记简介完整PPT资料.ppt
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,T细胞标志,进入外周淋巴器官和血液,执行免疫功能,CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-,CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR-(即CD4、CD8双阴性),CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+(即CD4、CD8双阳性),CD7+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8-、TCR+,CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8+、TCR+,CD3+、CD4+、CD8-:
T辅助/诱导细胞(Th/Ti),占T细胞总数的60%70%;
CD3+、CD4-、CD8+:
T抑制/杀伤细胞(Ts/Tc),20%30%;
CD3+CD4+CD8+:
1%3%;
CD3+CD4-CD8-:
1%10%。
前三种表型细胞的TCR主要为TCR,而CD4-CD8-T细胞主要表达TCR,他们都执行细胞免疫功能。
正常外周血中通常存在的T细胞亚群,CD2是绵羊红细胞受体和淋巴细胞功能相关抗原-2(LFA-2),表达于人95%T细胞、50%70胸腺细胞和大颗粒淋巴细胞(LGLNK)的表面。
CD3是T细胞表面抗原,表达于成熟胸腺细胞、静息和激活的的外周血T细胞,是鉴定T细胞的重要标志,其胞浆和膜CD3是早期和普通型T细胞白血病的主要分型标记。
CD5、CD7是T细胞白血病较特异的标记,也是髓系白血病时最常见的伴随标记。
CD45则是白细胞的共同标记抗体CD25和CD28主要分布于活化T淋巴细胞表面,为活化T淋巴细胞标志。
胸腺细胞、静止T细胞、静止B细胞以及NK细胞表面无表达。
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和II类人类白细胞抗原(HLA-DR)的阳性表达对早期T细胞白血病的诊断有重要价值。
8090和95以上的NK细胞表达CD16和CD56。
用CD3-CD16+CD56+可定义NK细胞。
B细胞标记,B细胞B细胞的分化主要分为B祖细胞、前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞6个阶段。
(1)B祖细胞(pro-B):
此期最早表达的B细胞特异性抗原是CD19,同时表达CD34、细胞核TdT、HLA-DR、CD40、CyCD22。
(2)前B细胞(pre-B):
CD34和TdT消失,出现CyCD79、CD10、CD20、CD9、CDw78、CD74,c+(胞浆IgM重链)。
(3)未成熟(早期)B细胞(immatureBcell):
CD9、CD10消失,出现SIgM、CD22。
CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表达增加。
其他新的B抗原CD37、CD2、CDw75、CDw76相继出现。
(4)成熟B细胞(matureBcell):
SIgM和IgD同时表达,并出现CR、FcR和丝裂原受体,上述B细胞抗原继续存在。
(5)活化B细胞(activatedBcell):
成熟B细胞被抗原或丝裂原刺激后,成为活化B细胞,继之增生和分化。
在此过程伴随表达B细胞激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相关抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、CD38等。
膜结合型Ig逐渐减少,分泌型Ig逐渐增加。
(6)浆细胞(plasmacell):
激活B细胞进一步分化成为产生抗体的浆细胞,这时获得PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原,CD85表达增加,CD38抗原再出现。
而SIg和上述B抗原消失。
CD79仍可存在于胞质中。
B细胞上的CD抗原分为:
B细胞限制性(特异性)抗原:
CD19、CD20、CD21、CD22、CD77和CD79,它们的表达只限于B细胞上,在鉴别细胞系上是十分重要的标志。
B细胞相关性抗原:
CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。
B细胞表面的受体SIg,是B细胞特异性识别抗原的受体,也是B细胞重要的特征标志。
CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。
对中国人而言,CD19是特异性和敏感性最高的。
CD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞表面抗原,从最早期B细胞前体细胞阶段即表达,持续存在直至B细胞终末阶段外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板表面不表达CD19。
髓系细胞标记,包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、CD61、CD63和CD117等。
这些免疫标记种类繁杂,缺乏特异性和敏感性(与淋巴细胞标记抗体相比)。
3.髓系标记从髓系祖细胞终末分化的成熟细胞(粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞)间各阶段细胞特征性标志还不十分清楚。
根据粒细胞和单核细胞上的髓系抗原表达试将其大致分为七种类型:
(1)粒细胞和单核细胞上都有较强表达的抗原有:
CD13、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、CD156、CD157、CD163。
其中CD13在原粒细胞质中表达比膜上早,在AML诊断上十分重要。
(2)以粒细胞为主,但也存在于单核细胞的抗原有:
CD15和CD65。
CD65是特异性髓系抗原,强表达在成熟粒细胞,弱表达在单核细胞上。
(3)基本表达在粒细胞上的抗原有:
CD16b和CD66。
(4)以单核细胞为主,但也表达在粒细胞的抗原有:
CD14和CD33。
CD14主要强表达在单核-巨噬细胞,弱表达在粒细胞上。
CD33抗原分布只限于造血系统内,表达在髓系祖细胞CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相应的白血病细胞上。
(5)基本只表达在单核细胞上的抗原有:
CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。
CD68是目前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞系统的特异标志。
(6)造血干、祖细胞抗原有:
CD34和CD90。
CD34除表达在早期造血干、祖细胞外,还表达在约40%的AML和60%的ALL上(7)其他髓系相关抗原:
这些抗原主要存在于其他系细胞上,但在某些髓系细胞上也有表达,如:
CD4、CD7、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。
巨核细胞系在巨核细胞系发育过程中依次出现PPO、CD41a(b/a)、CD41b(b)和CD61(a)、CD42(b)。
还可表达CD36(强)。
正常情况下血小板处于静止状态。
目前研制出的抗血小板单抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD61,主要都针对静止的血小板。
当血小板被激活时,血小板中颗粒内容物释放,整合到活化的血小板质膜内,成为一些激活抗原,如CD62(P-选择素)、CD63及CD107a和CD107b。
红细胞系血型糖蛋白A、H。
流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择,有特异性标志:
选择一种即可,如CD3标记总T细胞;
没有明显的特异性标志:
可以采用不同抗体组合,标记某种细胞。
如Treg细胞公认的标志为CD4+CD25+FoxP3+.表面分子标记可以与胞内分子标记相结合;
免疫荧光标记也可以与其它的标记方法相结合:
如与CFSE进行不同细胞亚群增殖分析。
流式细胞术表面分子免疫标记操作举例,淋巴细胞亚群检测操作程序,一、实验原理:
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类:
T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。
T淋巴细胞表达CD3;
B淋巴细胞表达CD19;
NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16,并且不表达CD3。
利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合,再配多色荧光染料,即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。
进面得到各亚群的比例。
二、主要试剂:
MultiTESTIMKKit(美国BDBiosciences公司;
CAT:
340503),其中包括:
1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC3、FACSLysingSolution三、实验操作:
1、标本采集:
使用EDTA-K2抗凝真空采血管,抽取静脉血2ml。
2、染色和固定细胞:
标本管编号A,取两只流式专用管A1、A2。
A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC20uL;
A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC20Ul。
A1、A2管中分别再加入全血100Ul,混均。
置室温,避光孵育15min。
加入FACSLysing溶血液2.0ml,置室温,避光孵育10min。
300g离心5min,弃上清液。
PBS洗涤细胞两次,300g离心5min,弃上清液。
1%多聚甲醛0.5mL。
3、上机检测;
分析结果;
打印实验报告。
流式细胞术胞内分子免疫标记操作流程,流式细胞术胞内分子免疫标记操作举例,B淋巴细胞胞内ZAP-70分子检测操作程序,主要试剂:
【临床意义】,
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