对苯二酚与牛血清白蛋白相互作用研究Word格式.docx

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人血清白蛋白存在于血液中，分子量为66241，等电点为47〔1〕，主要维持血浆的胶体渗透压，其另一功能是与许多微溶于水的物质结合为易溶于水的复合物。

酚类化合物对DNA有不同程度的损害〔2-5〕，对苯二酚在环境中容易氧化为对苯二醌，对苯二酚与对苯二醌可以和DNA碱基形成加合物〔6-8〕，对人体危害极大。

对苯二酚与对苯二醌是通过人血清白蛋白转运进入人体各器官。

因此，研究血清白蛋白与对苯二酚与对苯二醌的相互作用具有重要意义。

本文利用循环伏安法研究了对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为，并初步探讨了在L半胱氨酸上牛血清白蛋白与对苯二酚及对苯二醌相互作用的机制。

　　1材料与方法

　　11仪器与试剂缓冲液：

005mol/LNa2HPO4-005mol/LNaH2PO4-010mol/LNaCl缓冲溶液（用NaOH调pH）；

005g/LL半胱氨酸；

01mol/LH2SO4；

20000g/L对苯二酚。

200000g/L牛血清白蛋白。

MEC-12B型多功能微机电化学分析仪（江苏电分析仪器厂）；

金电极（直径1mm）为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。

　　12实验方法

　　121L半胱氨酸在金电极上组装将金电极在置于005μmAl2O3粉末中反复抛光至镜面，用Microcloth抛光布抛光光亮，再用丙酮冲洗，用亚沸水超声波清洗。

将金电极置于01mol/LH2SO4中于2V氧化5s,-035～15V于1V/s循环扫描5次，取出金电极，用蒸馏水冲洗干净，用磁力搅拌器在蒸馏水中清洗5min，将清洁后的金电极置于50g/LL半胱氨酸浸泡24h，取出金电极，用蒸馏水冲洗干净，用磁力搅拌器在蒸馏水中清洗5min，即得L半胱氨酸修饰金电极。

所用水为3次亚沸蒸馏水。

　　122电化学行为在500ml容量瓶中，加入010ml对苯二酚，500ml005mol/LNa2HPO4-015mol/LNaCl缓冲溶液，混匀，作循环伏安扫描。

　　13量子化学计算对苯二酚与对苯二醌用半经验方法（AM1）进行分子几何构型初始优化，然后用密度泛函理论（DFT）在6-31G（d）水平进行全优化分子结构，在相同水平计算分子的分子前线轨道能量及静电荷。

用Gaussian03软件完成所有计算。

　　2结果

　　21L半胱氨酸修饰电极的电化学行为特征（图1）由修饰电极于-060～08V范围内的循环伏安图可见，裸金电极上未见氧化还原峰存在；

L半胱氨酸修饰电极在高电位的电流增大，溶液pH=730时，在-0068V产生一个氧化峰，这可能是羧基在较低的电位下被还原为羟基所致。

　　22对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为（图2，表1）从表1可见，在L半胱氨酸修饰金电极上，当溶液pH=730时，氧化峰（Epa）比裸金电极负移了0169V，还原峰（Epc）比裸金电极负移了0061V，对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极可逆性变好，峰电流变大，对对苯二酚的氧化还原具有催化作用。

结果与杜丹等人研究对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为一致〔9〕。

当溶液pH=1100时，在L胱氨酸修饰金电极上的氧化峰比裸金电极正移了0090V，还原峰比裸金电极负移了0010V，说明在pH-1100时，对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极可逆性变坏，峰电流变小，对对苯二酚的氧化还原不具有催化作用。

　　表1对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极及裸金电极上的电化学参数

　　23扫速对对苯二酚峰电流和峰电位的影响对苯二酚在裸金电极上的氧化还原峰电位随着扫速的增大氧化峰电位发生正移，还原峰负移，峰电流（ip）与扫速的平方根（V1/2）成正比，说明峰电流受扩散控制；

对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上的氧化还原峰电位受扫速的影响与裸金电极相似，峰电流（ip）与扫速的平方根（V1/2）成正比，说明峰电流也受扩散控制。

　　a,a`:

裸金电极；

b,b`:

L半胱氨酸修饰电极；

扫描速度：

100mv/s

　　图1L半胱氨酸修饰金电极上的循环伏安图

00400g/L对苯二酚在裸金电极上；

00400g/L对苯二酚在L半胱氨酸修饰电极上；

　　图2对苯二酚在L半胱氨酸修饰金电极上和裸金电极上的循环伏安图

　　24牛血清白蛋白对峰电位与电流的影响（图3）由于牛血清白蛋白容易吸附到金电极上，故在修饰电极上研究了牛血清白蛋白在pH=730溶液中对对苯二酚氧化还原电位及电流的影响。

从图3可见，牛血清白蛋白加入到对苯二酚溶液时，其氧化峰电位发生负移，但峰电流改变不大，说明牛血清白蛋白对对苯二酚向电极扩散的影响较小；

而对其氧化产物对苯二醌，其氧化峰电位发生负移，峰电流变小，说明牛血清白蛋白对对苯二醌的扩散的影响较大。

当牛血清白蛋白的浓度达到05000g/L时，峰电位不再改变，说明牛血清白蛋白与对苯二酚结合达到饱和状态。

当牛血清白蛋白的浓度达到12000g/L时，峰电流不再改变，说明牛血清白蛋白与对苯二醌结合达到饱和状态。

根据苯二酚和对苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量，计算苯二酚和对苯二醌和血清白蛋白结合比分别为48：

　　a:

00400g/L对苯二酚;

b:

00400g/L（15800g/L）牛血清白蛋白；

pH=730；

　　图3牛血清白蛋白对苯二氧化还原电位及电流的影响

　　25对苯二酚现对苯二醌的量子化学计算结果对苯二酚与对苯二醌所有原子都在一个平面内，对苯二醌的最大净电荷为043，最小的负电荷为-045，最低空轨道和最高占有轨道能量分别为-012999和-027059Hartree,分子的偶极距为0，为非极性分子；

分子的净电荷反映了分子间净电吸引的能力；

最低空轨道能量越低，越容易接受电子，最高占有轨道能量越高越容易提供电子，分子的前线轨道反映了形成分子氢键的能力，故对苯二酚较对苯二醌容易提供电子，而对苯二醌较对苯二酚容易接受电子。

由此来看，对苯二醌比对苯二酚具有较大的净电吸引的能力和形成分子氢键的能力，因而在电极上峰电位和峰电流改变较大。

　　3讨论

　　结果表明，在pH730时主要以NH3-C（R）OO-存在，pH1100时主要以NH2-C（R）OO存在。

具有较好催化活性的基团为NH3-C（R）OO-。

苯酚的pKa1=1000时，主要以苯酚分子的形式存在，而对苯二酚的羟基是供电子基团，故pKa11100，对苯二酚在水溶液主要以分子形式存在。

由于对苯二酚氧原子的电负性较大，因而使羟基和邻近苯环氢具有较低的空轨道，可接受NH3-C（R）OO-氧原子的电子，形成氢键，降低了氧化电位，增大了电流。

对苯二醌的氧原子具有更高的净电荷，具最高占有轨道能量更高，最低空轨道能量更低，形成氢键的能力更强。

当pH较高时，由于氨基接受氢的能力大于羧基，对苯二醌与L半胱氨酸形成氢键时，电子的流动性较差，因而电流较小。

参照人血清白蛋白等电点为47，氨基酸残基如NH3-C（R）OO-存在，牛血清白蛋白对苯二酚和对苯二醌在溶液中的结合，与对苯二酚和对苯二醌在电极上的表现有所差异，对苯二酚和对苯二醌与与对苯二酚和对苯二醌结合后，电极为了破坏这种氢键作用力，必须提供更高的氧化电位和较低的还原电位，这种作用力越强，电位偏离越远，同时强烈的作用将进一步导致复合物扩散系数变小，电流变小。

本文结果表明，对苯二醌可以和血清白蛋白形成较强的氢键，且苯二醌和血清白蛋白的作用力要大于对苯二醌的作用力。

根据苯二酚和对苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量计算苯二酚和对苯二醌和血清白蛋白结合比分别为48:

1和16:

【参考文献】

　　〔1〕张昌颖.生物化学［M］.2版.北京：

人民卫生出版社，1985：

432.

　　〔2〕宋远志.对苯二酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2006，22

（2）：

192-194.

　　〔3〕宋远志.苯酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21（12）：

113-114.

　　〔4〕宋远志.对硝基苯酚与杂交中DNA的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21

（1）：

33-35.

　　〔5〕宋远志.邻氨基酚与脱氧核糖核酸的相互作用［J］.中国公共卫生，2005，21（9）：

94-96.

　　〔6〕KrisztinaPongracz,William　of3‘-Hydroxy-1,N6-benzetheno-2‘-deoxyadenosine3‘Phosphateby32PPostlabelingofDNAReactedwithpBenzoquinone［J］.ChemResToxicol，1991,4:

199-202.

　　〔7〕MargaretGaskell,RebekahJukes,Donald　andCharacterizationof（3,4-Dihydroxy）-1,N2-benzetheno-2-deoxyguanosine3-Monophosphate,aNovelDNAAdductFormedbyBenzeneMetabolites［J］.ChemResToxicol，2002,15:

1088-1095.

　　〔8〕MargaretGaskell,KeithIEMcLuckie,Peter　ofthebenzenemetabolitespara-benzoquinoneandhydroquinone［J］.Chemico-BiologicalInteractions，2005,153

（1）:

267-270.

　　〔9〕杜丹，王升富，黄春保.L半胱氨酸修饰金电极对对苯二酚和对苯二酚的电催化及分析应用［J］.分析测试学报，2001，20（5）：

18-20.