PCR检测常见问题与解决途径docWord下载.docx
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3.PCR扩增产物污染:
这是
PCR贝
反应中最主要最常见的污染问题。
因为
PCR产物拷
量大一般为
1013
拷贝
/ml)
,远远高于物
PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的
PCR产
(
污染,就可形成假阳性。
4.气溶胶污染:
在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动
反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5.实验室中克隆质粒的污染:
由于克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很
强的生命力,其污染可能性也很大。
在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题比较常见。
(三)假阳性问题的试验控制
在每次PCR检测时,一定设立阴性对照样品和阳性对照样品。
阴性对照样品检测为阴
性时,表明试验全部过程的试剂没有受到污染;
阳性对照样品检测为阳性时,表明DNA提
取(RNA提取、RNA反转录)、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。
在阴性对照样品和阳性对照样品检测结果成立的前提下,才能对检测样品进行判定。
只有设立试验全程的对照,才能证明试验结果成立。
造成假阴性的原因可以通过设置试验对照来查找。
试验对照包括:
1、DNA阳性对照:
以含有目的片段的DNA(或质粒)作为模板进行扩增,证明PCR
试剂是否有效、扩增过程是否正确及待测样品中是否含有目的片段。
(注意:
阳性样品扩增
效率高,应严格控制,避免其成为潜在的污染源)。
2、DNA阴性对照:
以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象。
3、空白对照:
以纯水作为模板进行扩增,用于证明扩增过程中无假阳性现象。
4、PCR抑制物对照:
在与阳性对照相同的反应体系中,加入相同数量的待测样品
DNA,如果未扩增出目的片段,证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。
5、空白提取对照:
空白提取对照扩增结果为阳性,说明DNA提取试剂可能受到污染。
6、阳性提取对照:
阳性提取对照扩增结果为阴性,说明提取过程可能有误。
如果DNA阳性对照扩增结果为阴性,或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性,
则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。
(四)假阳性解决途径
由于PCR
的敏感性和效率特别高,所以少量的扩增产物污染标本或反应管即可出现
假阳性。
尤其是
PCR扩增产物和质粒分子很容易造成实验室的污染
,导致假阳性现象发生。
1、规范实验室设计
实验室设置上分配液区、DNA提取区、扩增区、电泳区。
物流应按分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区顺序,严禁倒流。
在连续而独立的空间中完成不同实验步骤。
不同工作区域相互隔离,通过传递仓传递。
PCR
前处理区(样品制备室、
DNA
提取室)和
准备室设置正压通风系统,并设
置通风柜或生物反应柜造成局部负压;
后PCR室(PCR室及电泳室为高度污染区)压通风系统,防止大量游离分子及气溶胶,对其它区域造成环境污染。
设置负
配制PCR反应体系(配备冰箱及生物安全柜,此实验室要求无模板系中加入模板DNA(配备生物安全柜及冰箱)要求在不同区域进行。
反应体
存在)和向
2、规范试剂耗材管理
1)验证:
新购买的试剂需进行实验前验证;
2)分装:
双蒸水、引物和dNTP均应分装储存,并标明日期,以防污染;
试剂的分装应在装有紫外灯的超净工作台上进行;
试剂分装成小份一次使用后弃去。
3)消毒:
除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
必要时,在加样本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
3、规范实验室操作
1)控制污染源:
PCR产物和质粒操作空间是最大的污染源,应严格防止将这个空间的物品带出;
2)一次性用具:
使用实验服和一次性手套,使用带有滤膜的移液器枪头,一次性反应管和离心管;
3)定期消毒:
定期对实验室进行紫外照射,用10%漂白剂、3%双氧水或专用商业产
品清理实验室台面及死角。
4)定期通风:
对实验室定期进行正压、负压通风处理;
5)小心操作:
操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;
加样时,最后加阳性对照。
4、技术处理
1)在DNA
物。
一般选用波长
模板和多聚酶加入前,紫外线照射反应管内容物以破坏污染的
254nm照射30min(Nature,1990,34:
27
);
产
2)PCR实验中使用dUTP
,而不用dTTP。
在扩增前使用
UraciIN
一g1ycosylase
(尿嘧啶糖基化酶)处理可降解交叉污染的
产物,而不降解基困组
DNA模板,
后热灭活此酶,再进行扩增反应(
Gene,1990
,93:
125
)。
美国PE
然
剂盒;
公司提供此类试
3)在PCR反应前加入一种光化学试剂,反应完成后激活该试剂,光化学试剂可交联
DNA链,使之不能再扩增(NucleicAcidsRes,1991,19:
99)。
二、假阴性
(一)假阴性现象与判断方法
如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果,提示本次实验中可能有假阴性结
果。
但这里应注意,许多国产PCR试剂盒中阳性对照采用质粒DNA,和标本相比来说,不需纯化提取核酸的步骤,因此,如果在标本核酸纯化提取步骤有问题,即使阳性对照均呈阳
性,标本检测中还可能有假阴性。
设置内标准基因对照是判断假阴性较好的指示系统。
在每一反应管中同时对内标准基因对照进行扩增,若内标准基因对照未能扩增出来,说明该反应管的结果可能有问题。
(二)造成假阴性的原因
1.仪器因素
实验对仪器的依赖性是很高的,离心机、扩增仪都是造成
假阴性的因素。
扩增仪的主要问题是孔间差,引起扩增失败或扩增效率降低。
而离心机的影响则更容易被忽
视。
国内使用离心机很少使用离心加速度(XXXg)作为参数指标,而常使用转数作为参数
指标,这里就存在着一个问题,由于离心机的大小不同,有效跳心半径也不相同,因此同样
的转速所产生的离心力相差很大(有的在数倍以上),所以在相同的离心时间下,有可能模板
并没有离心下来,造成PCR假阴性。
这个问题在其他实验也有,但因其他实验都是测定大分子蛋白沉淀,对离心的速度要求较低所以不太明显。
建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。
2.试剂质量问题
PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要,试剂的质量问题涉及多个方面:
细胞的裂
解;
模板的抽提;
引物位点的选择;
Taq酶的活性等等。
其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。
这些都是试剂质量的问题,因此选用高质量的PCR试剂非常重要。
酶失活:
需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而
导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物:
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条
带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,
一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:
①选定一个好的引物合成单位。
②引物
的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,
而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做
有
可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
3.核酸模板问题
1)模板中含有杂蛋白质;
2)模板中含有
Taq
酶抑制剂;
3)模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白;
4)在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;
5)模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
4、物理原因:
PCR仪控温不准,也是PCR失败的原因之一。
有时还有必要用标
准的温度计,检测一下扩增仪内的变性、退火和延伸温度。
5、靶序列变异:
如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列
某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
6.操作人员素质问题
PCR实验的环节很多,而且对每一环节的质量要求都很高,例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误等等都能造成结果的假阴性。
(三)假阴性问题的试验控制
阳性对照样品检测为阳性时,表明DNA取提
(RNA提取、RNA反转录)、DNA扩增和电泳鉴定工作体系正常。
以含有目
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