高中生物 第4章 现代生物技术 第15课时 聚合酶链式反应技术同步备课教学案 北师大版选修1Word文档下载推荐.docx
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答案 左链上5′端,下3′端;
右链上3′端,下5′端。
2.细胞内DNA复制条件分析
条件
组分
作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核糖核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶
打开DNA双螺旋
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
能量
ATP
为解螺旋和合成子链供能
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3′端起点
3.PCR原理与反应过程
(1)PCR概念:
是一种体外酶促合成特定DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2)条件及作用
待扩增的目的DNA片段
作为复制的模板
两种人工合成的单链DNA片段
合成DNA时所需要的特异引物
四种三磷酸脱氧核苷酸
耐热TaqDNA聚合酶
酶促作用
缓冲溶液
反应介质
(3)反应过程
①变性
温度上升到94~98℃时,目的DNA双链变性解旋为单链模板。
②复性
温度下降到40~60℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸
温度上升到72℃左右,溶液中的四种脱氧核糖核苷酸在耐热的TaqDNA聚合酶的作用下。
根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
④循环:
继续上述的3个过程,DNA片段被不断的扩增。
若开始加入了N个DNA模板片段,理论上,循环n次后能获得N·
2n个DNA片段。
1.PCR原理
PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同?
请分析原因。
答案 不相同。
体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA,但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。
2.PCR反应过程
(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗?
若需要,则与细胞内DNA复制有何区别?
答案 PCR反应不需要解旋酶,但需要DNA聚合酶。
由于PCR反应中需要高温使DNA解旋,因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。
(2)PCR的每次循环中应如何控制温度?
答案 每次循环中先高温解旋,再低温使引物与模板结合,最后适当升温有利于TaqDNA聚合酶发挥作用。
(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的?
答案 DNA的羟基(—OH)末端为3′端,磷酸基团的末端为5′端。
当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链,DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
归纳总结 PCR扩增与DNA复制的异同
项目
DNA复制
PCR扩增
不同点
时期
有丝分裂间期或减数分裂Ⅰ前的间期
任何时期
场所
活细胞内
细胞外
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的TaqDNA聚合酶
有转录,产生RNA作引物,无需人工加入
无转录,无引物产生,需人工加入两种DNA引物
特点
边解旋边复制
先全部解旋后开始复制
缓冲液
不需缓冲液
配制缓冲液代替细胞核液
设备
无
控制温度变化的温控设备
相同点
原理
严格遵循碱基互补配对原则
都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
DNA的两条链为模板
半保留复制
游离的四种脱氧核苷酸
1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中,正确的是( )
A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从5′端延伸DNA链
B.DNA复制不需要引物
C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.PCR扩增的对象是氨基酸序列
答案 C
解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,故DNA复制需要引物;
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链,而不能从5′端延伸DNA链;
引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合;
PCR扩增的对象是DNA,不是氨基酸序列。
2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题,而被广泛应用,与细胞内的DNA复制相比,PCR可以快速扩增所需的DNA片段,请分析回答下列有关问题:
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA,而PCR技术中的解旋原理是_________。
(2)此过程需要一种TaqDNA聚合酶,该酶是从____________________中分离的。
(3)与普通DNA聚合酶相比,TaqDNA聚合酶具有的特性是______________。
(4)与体内DNA复制相比较,PCR反应要在______________中才能进行,并且要严格控制________条件。
(5)PCR中加入的引物有________种,加入引物的作用是____________________________。
答案
(1)DNA的热变性原理
(2)水生耐热细菌Taq (3)耐高温 (4)一定的缓冲溶液 温度 (5)2 作为DNA复制的起点
解析
(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开,从而解旋,其原理是DNA的热变性原理。
(2)TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。
(3)与普通DNA聚合酶相比,TaqDNA聚合酶在90℃以上的环境中不变性,具有耐高温的特性。
(4)PCR反应需要适宜的温度和pH,因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行,并需严格控制好温度条件。
(5)PCR需要两种引物,引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。
PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA,作用是引导DNA复制,可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键,成为DNA复制的起点。
一题多变
细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗?
若需要,是如何实现的?
答案 需要。
细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关,低等生物与环境因素有关。
易错提醒 与PCR原理有关的三个易错点
(1)酶的作用位点:
解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开;
DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。
不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶和DNA连接酶:
DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上,需要模板;
而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板。
(3)PCR中的解旋过程:
PCR过程中不需要解旋酶,需要升高温度才能打开氢键,但此时的温度不会破坏磷酸二酯键,因此,DNA加热变性后变为单链,并未分解成单体。
二、DNA片段的PCR扩增和产物检测
DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成,而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。
阅读教材,完善下列内容:
1.DNA片段的PCR扩增
准备:
按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上
↓
移液:
用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分
混合:
盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁
离心:
将微量离心管放在离心机上,离心约10s,目的是使反应液集中在离心管底部
反应:
将离心管放入PCR仪中,设置程序进行反应
(1)加入离心管中的物质应包括:
模板DNA、TaqDNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核苷酸、2种引物、缓冲液。
(2)离心管中要加入少量石蜡油,目的是防止反应溶液的挥发。
(3)热循环仪的反应程序应设定为:
(4)影响因素:
在PCR实验中,需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间,片段越大,中温延伸的时间越长;
引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择,如果引物越短,A、T含量越多,复性温度就越低,反之引物越长,G、C含量越多,复性温度就越高,这是因为G、C之间是由3个氢键连接,A、T之间是由2个氢键连接。
(5)PCR过程中,循环次数是不是越多越好?
答案 不是。
TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1×
10-5的出错几率,而且随着循环次数的增加,其活性也会逐渐降低。
因此,PCR过程中,循环次数并非越多越好,一般控制在25~35个循环。
2.扩增产物的检测
(1)原理:
琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔,带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。
DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小,因此大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。
(2)过程
配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶,制作成电泳胶板
↓
在DNA样品中加入0.2倍体积的载样缓冲液混匀
取20μL加入样品孔内
80V稳压电泳20~40min
当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时,切断电源
将胶板浸入溴化乙锭溶液染色5~10min
在紫外透射仪上观察电泳条带
1.实验过程分析
(1)离心的目的是什么?
在离心的过程中,微量离心管的盖子为什么一定要盖严?
答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效率。
微量离心管的盖子一定要盖严,防止实验中脱落或液体外溢。
(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁,目的是什么?
答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。
(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌,为什么这样操作?
还有哪些操作与此目的相同?
答案 为避免外源DNA等的污染。
在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。
2.结果检测
(1)实验中为什么要测定DNA的含量?
答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量,所以需要对DNA含量进行测定。
(2)如何判断DNA扩增成功?
答案 ①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。
②电泳检测的方法,可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果?
答案 样品产物少,或产生新的DNA。
归纳总结 PCR扩增DNA片段的操作要点
(1)避免外源DNA的干扰,所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。
(2)缓冲液、酶、DNA引物和DNA模板等如果长期保存,需要在-20℃冰箱内保存。
其中,DNA引物和DNA模板要避免反复冻融,否则容易造成DNA的降解。
(3)在用微量移液管混合PCR反应体系的各种成分时,一定注意避免各种溶液之间的相互污染,需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。
(4)为防止DNA引物与模板DNA在室温非特异性结合进行PCR反应,需在冰盒上混合PCR扩增体系的各种组分。
(5)为避免反应过程中高温使EP管中的水蒸气溢出管外而导致PCR过程中各种成分的浓度发生变化,须在PCR反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。
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- 高中生物 第4章 现代生物技术 第15课时 聚合酶链式反应技术同步备课教学案 北师大版选修1 现代 生物技术 15 课时 聚合 链式反应 技术 同步 备课 教学 北师大 选修
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