基因组学研究进展论文文档格式.docx

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Abstract:

TILLINGtechnologyisakindofbrand-newreversegeneticsstudymethod,itprovidesahighthroughput,lowcost,scalizationandefficientscreeningchemicalmutagenEMSinducedproducepointmutationsoftechnology.ThispaperbrieflyintroducedtheTILLINGtechnologyprincipleandcharacteristicsofplants,andinitsfunctionalgenomics,cropcultivarimprovementandinbiologicalevolutionandtestingpolymorphismapplicationwasdiscussed

关键词：

TILLING技术反向遗传学点突变

前言

随着愈来愈多的植物的基因组测序的完成，以表型挑选为主的正向遗传学方式正慢慢被反向遗传学方式替代而成为功能基因组学研究的要紧方式。

反义RNA抑制、RNAi和插入突变是植物中经常使用的用于反向遗传学研究的方式，但这3种技术均需复杂繁琐的植物转基因表达载体构建进程和组织培育、基因转化和周期极长的转基因植物挑选进程，作为常规方式仅限应用于极少数物种[1]。

基因组靶向定位诱导损伤技术（targetinginducedlocallesionsingenomes，简称TILLING）是美国华盛顿Hutchinson癌症研究中心以Henikoff为首的科学家进展成立的[2]。

它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方式与PCR挑选技术和Li—Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合，快速有效地从化学诱变剂甲基磺酸乙酯（ethylmethanesulfonate，EMS）诱变产生的突变群体中鉴定出点突变，这一全新的、高通量、低本钱的反向遗传学研究方式大大地址便了植物基因组学的研究。

在TILLING技术基础上进展起来的Ecotilling（ecotypicTILIING）

技术不用化学诱变，能够直接探知存在于特定群体中某个基因或基因群的多态性（等位基因），识别单碱基突变（SNP）、小片段插入、微卫星重复等，为基因功能研究和生物进化提供重要信息[3]。

最初的TILLING是利用DHPLC对DNA池中的突变进行检测（McCallumetal.,2000a;

2000b）。

为了进一步提高那个方式的效率，适应大规模挑选的要求，Colbert等（2001）对TILLING作了改良。

他们将所获PCR片段先用特异性识别错配碱基的内切酶酶切异源双链核酸分子，再用变性的序列胶电泳分离酶切产物，用标准的图像处置程序分析点突变的存在。

有几种酶已经被用于错配碱基的特异性识别、切割，包括S1核酸酶（Howardetal.,1999）和T4核酸内切酶Ⅶ（Youiletal.,1996）。

目前，利用较多的是S1核酸内切酶家族中的CELI酶，它是一种从芹菜（celery）中分离出的植物所特有的核酸内切酶（Oleykowskietal.,1998）。

CELI酶能够识别错配碱基并在错配碱基的3'

端进行切割，再用变性的序列胶（PAGE）分离酶切产物，能够将超过1kb的PCR扩增产物内的点突变定位在几个碱基对内。

因此，改良的TILLING充分运用了CELI酶和凝胶电泳技术，从而使其成为一个低本钱、高通量的挑选突变基因的技术平台。

TILLING技术的大体原理是：

第一是运用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变而取得突变群体，提取DNA并把多个待测样品DNA混合成立突变群体及其DNA池，然后利用特异性引物对特定DNA区段进行PCR扩增，通过变性和复性进程取得异质双链。

若是有突变发生，那么形成的异质双链中将含有错配碱基。

利用特异性的核酸内切酶识别错配碱基的异质双链并在错配处切开双链，最后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

若是发觉阳性结果，那么再在混合的样品中一一检测，最后确信阳性样本。

1TILLING技术线路

TILLING技术先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变，再用设计的特异性引物进行PCR扩增，而后将PCR扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶CELl酶切，最后变性处置后采纳双色聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳检测分析[4]。

包括S1核酸酶和T4核酸内切酶Ⅶ在内的几种酶已用于碱基错配的特异性识别和切割，其中应用较多的是S1核酸内切酶家族中的CELl酶[5]。

那个进程中起重要作用的CELl酶是从芹菜中分离的植物特有的核酸内切酶，它能够识别单碱基错配并在错配碱基的3端进行切割，酶切产物经变性PAGE胶分离，能将超过1kb的PCR产物内的点突变定位在几个碱基对内[6]。

TILLING的具体操作步骤是[7]：

⑴EMS（EthylMethaneSulfonicacid

）处置种子，诱导产生一系列点突变；

⑵将种子培育，取得第一代突变个体（M1）；

⑶M1植株自花授粉，产生第二代植株（M2）；

⑷M2植株抽提DNA寄存于96孔微量滴定板，并保留M2代种子；

⑸将多个96孔板的DNA样本归并到一个96孔板内（最多可归并8个）取得DNA池；

⑹依照目标基因序列设计一对特异性引物进行PCR扩增，两个引物别离用700nm和800nm荧光染料标记；

⑺PCR扩增片段变性、退火，从而取得野生型和突变型所形成的异源双链核酸分子；

⑻用特异性识别并切割错配碱基的核酸内切酶剪切异源双链核酸分子；

⑼酶切产物用变性的聚丙烯酰胺（DPAGE）凝胶电泳分离，然后用标准的图象处置程序分析电泳图象，取得突变池；

⑽利用相同方式从突变池中挑选突变个体；

⑾突变个体PCR片段测序验证；

⑿突变表型鉴定

TILLING技术中的引物设计

依照目标基因序列设计特异引物，是TILLING分析的一个重要步骤，引物设计的好坏直接阻碍TILLING挑选的结果。

Taybr和Greene专门为拟南芥TILLING项目研究开发了CODDLE程序[8]。

CODDLE不仅能识别各类形式的序列信息，按输入的碱基序列产生基因模型和蛋白质保守区域模型，还能列出EMS诱导植株产生有害突变的可能范围，当1kb左右的区段被选中后，系统将会依照最有可能突变成为高频率终止密码子的区域或进化保守区域设计引物[9]。

设计完成后，研究人员可用Primer3程序对C0DDIE列出的候选引物加以选择口，然后在MWGBiotech订购引物。

TILLING引物设计的前提条件是要明白自己想研究基因的序列信息，其基因序列信息能够是基因组序列，也能够是cDNA序列[10]。

在应用Ecotilling于生物进化研究和检测多态性时，能够选择非编码区设计引物来取得更多的信息[11]。

TILLING技术中点突变的检测

点突变通常存在检测困难的问题，这也是TILLING应用上的关键障碍。

Collhert等将LI—C0R4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光检测技术引入TILLING中，大大提高了挑选效率[12]。

由于杂质、干扰分子在红外光区几乎不发光，用红外荧光检测不仅背景超级低，灵敏度也很高。

而TILLING实验进程中由于核酸外切酶活性会致使一些信号丢失，因此应用红外检测技术提高灵敏度关于TILLING检测超级重要。

相对经常使用的可见光检测，红外荧光检测具有背景低、灵敏度高的优势。

另外，结合红外荧光引物后，该检测方式还具有另一个优势——宽广的线性范围。

这一特点使得强信号和弱信号能够同时被分辨，当野生型条带的信号强，突变型条带信号弱时，LI—CORDNA分析系统也能够轻松识别突变。

应用TILLING

技术时，取得未经修改的图像原始数据关于检测的灵敏度和准确性都很重要。

若是检测系统在检测时对荧光数据已经进行了处置，极可能会过滤掉大部份乃至是全数的突变信息。

将红外荧光检测技术与TILLING技术结合后，能够同时取得两张真实的电泳图像，别离在700nm和800nm通道搜集，这两个通道检测波长相距100nm，几乎无光谱重叠的干扰，保证TILLING分析中每一个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。

通过PCR反映取得的异源核酸双链分子在碱基错配处被切断，由于两个剪切片断采纳不同的荧光染料标记，若是真的发生了突变，双色检测时将在野生型条带下面显现两个突变条带，别离位于700nm和800nm电泳图的同一泳道。

同时，这两个突变条带的分子量之和应该等于野生型条带的分子量，因此双色检测能够有效排除假阳性点突变，准确度很高。

TILLING技术中突变体及表型的鉴定

一旦在一个DNA池中检测到了一个突变，那么就要对那个DNA池中每一个单株的DNA样品进行挑选。

单株的DNA样品能够排列在一个8×

8的微量滴定板中，每一个DNA池对应一排（8个）DNA样品。

用一个有8个吸头的移液器将阳性DNA池对应的8个DNA样品转移至一个新的微量滴定板（8×

12）中。

因此每块板能够对12个阳性的DNA池中的所有单株进行挑选。

利用UNIX程序（pick）能够方便的将要挑选的每一块96孔板的每一行与阳性DNA池对应起来，并能以表格的形式将结果输出。

为了能够检测出突变，每一个单株的DNA样品中等量混入野生型DNA样品。

然后用与挑选DNA池一样的方式挑选突变个体，包括PCR扩增，CELI酶切，凝胶电泳，Grab、Photoshop等软件分析。

挑选结果能将突变位点定位在几个碱基对内。

用这种两次挑选的方式，挑选1kb左右的目标片段，每块胶大约能够挑选750kb的基因组序列（1kb×

8个单株DNA×

96孔）。

每一个96孔DNA池相当于768个单株，平都可挑选到7个点突变。

通过GelBuddy／SAGA软件分析所取得的电泳图像，在混合池里发觉了突变，再检测混合池里的单株，最后通过测序来确信突变单株。

取得突变序列以后，能够通过在SIFT和PARSESNP软件上预测确信了的突变类型。

随后能够对取得的错义突变和基因截短型损伤两个突变类型后期突变表型的确认。

第一种快速的方式是鉴定两个独立有害突变位点的个体，将二者杂交，分析后代的基因型。

在每一个含有非等位基因的个体中，均会发觉一个属于两个亲本之一的突变表型，而将不等位的突变单独归类；

第二种确实是将突变体与野生型杂交，观看突变是不是与表型在F2代共分离，F2代的突变体检测能够采纳TILLNG和dCAPS标记；

第三种方式确实是通过用目的基因进行转化看可否使突变体的表型得以恢复，从而将表型与目的基因联系起来[11]。

2TILLING技术的核心与特点

TILLING技术的核心

由上可见，如何有效识别异源双链中错配碱基是TILLING技术的核心。

从芹菜里提取的核酸酶CELI是被以为具有高度特异性识别错配碱基的真核剪切酶，它能够识别双链DNA中错配的碱基，但对各类错配碱基切割偏爱程度并非完全一样，表现为C/C≥C/A~C/T≥G/G>

A/C～A/A~T/C>

T/G~G/T~G/A~A/G>

T/T[13].CELI的最正确pH值为中性，具有274个氨基酸残基，分子量约31．44kDa,切割时需要Zn2+参与，同时Mg2+对其有效的切割3’端错配核甘酸