青霉素酰化酶的固定化与应用新进展文档格式.doc
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性能优越的载体能提高固定化酶的催化性能,降低酶法生产成本。
1.1.有机高分子载体有机载体具有较好的机械强度且已产业化。
天然有机高分子载体无毒性、传质性能好,常用甲壳素和壳聚糖[2]。
合成的有机高分子强度大,但传质较差,如聚乙烯醇[3]和聚丙烯酰胺[4]等。
mateo等[5]选用epsepabeads类高密度环氧结构的载体固定青霉素酰化酶,过程如图1所示。
pasini等[6]研究eupergitc载体固定化酶,催化活力较游离酶明显增加,重复使用稳定性好。
1.2.无机分子载体
随着材料学的迅速发展,出现了具有多维孔道结构介孔分子筛的载体,可制备高活性高稳定性的固定化酶。
何静等[7]报道的介孔分子筛mcm41具有高比表面积、较小扩散阻力的特点,可吸附固定,也可利用载体表面醛基与酶蛋白的氨基相互反应共价连接。
roger等[8]实验表明mcm41载体的孔径(3~3.5nm)明显小于青霉素酰化酶尺寸(7nm×
5nm×
5nm),载体可大部分与酶以吸附形式固定。
roger等研究了硅载体通过交联剂与酶共价固定的过程,如图2所示。
此硅载体孔径较大,固定化酶的干酶活力达110bpug-1,活力回收80%,热稳定性明显优于eupergitc固定化酶。
薛屏等[9]以mcm48介孔分子筛为载体,固定青霉素酶12h,相对活力65.10%;
肖清贵等[10]研制的中空硅微管载体,负载率和活力回收分
图1青霉素酰化酶与高密度环氧载体共价结合过程别为97.20%和88.80%;
bernardino等[11]研制的磁性硅载体可减少扩散阻力,便于催化剂分离回收;
王卫等[12]研究的磁性环氧颗粒载体最适ph和温度分别为8.5和45℃,交联密度为30%,固定化酶经使用80次仍保持94.2%的催化活力。
采取对无机载体先表面修饰再与酶固定的方法,性能有很大提高。
本课题组曾采用表面氨基的介孔二氧化硅固定青霉素酰化酶[13],相对活力达90%以上,循环使用10次后催化活力仍保持初始条件的94%。
此外选用介孔泡沫硅(mcfs)载体固定青霉素酰化酶,制得的mcfs载体[14,15]经电镜检测,颗粒表面密集分布大量孔道,孔径较大呈泡沫状。
由bet法计算得到mcfs的比表面积为331.43m2/g。
由bjh公式计算得到的孔体积及平均孔径分别为2.16cm3/g和26nm。
固定化酶负载率约95%,催化活力最高达200u/mg以上,载体性能较好。
1.3.复合载体
有机载体和无机载体各有优势。
有研究立足于结合这两种材质的载体,改进材料的性能,如针对壳聚糖颗粒机械强度不够和比表面积不大的缺点,用无机多孔材料硅藻土在低压下强化吸附壳聚糖以固定青霉素酰化酶,优化机械强度,固定化酶性能得到提高[16]。
2.青霉素酰化酶的固定化方法
固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。
载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法;
无载体固定法常用无载体交联酶和交联酶聚集体两种,不同固定化方法优缺点如表1所示。
2.1.载体固定法
吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定,可分为物理吸附和离子吸附。
物理吸附要求载体表面对蛋白质有高吸附性。
离子吸附是利用酶解离状态
图2带氨基的硅载体与青霉素酰化酶共价固定的过程表1不同固定方法的原理及优缺点
分类方法优点缺点文献载体固定法吸附法条件温和,操作简便酶负载强度低,易失活[17]包埋法酶本身不参与结合,简单易行扩散阻力问题,酶包埋中易失活[18]共价偶联法具有良好的稳定性酶活损失很大[19]无载体固定法
无载体交联酶
(clecs)
酶载容量较高,利于底物扩散产物分离。
在合成中能获得较高反应速率,晶体颗粒小,在高剪切力和液体运输下具有良好的机械稳定性和化学稳定性。
比固定化酶制备过程复杂
[8,20]
交联酶聚集体
(cleas)
避免耗时纯化,酶不易破坏可回收使用,催化水解重复20批次可保持100%活力。
半合成抗生素产率高。
对于较大分子量的酶形成聚集
体效果不佳
[21~26]
下与载体的电荷正负相吸原理固定酶。
包埋法[18]将酶包埋进载体孔径内固定,酶本身并不参与结合。
共价偶联法是利用酶的非必需侧链基团与载体的功能基团形成稳定的共价键而固定。
本课题采用mcfs载体、交联剂对苯醌和青霉素酰化酶共价结合,经0.1mol/lnacl溶液洗涤后,固定化酶负载率和酶活与未洗涤的固定化酶相比没有明显下降,证明载体mcfs与青霉素酰化酶是共价而非吸附固定。
2.2.无载体固定法
(1)交联酶晶体(clecs)晶体晶格中蛋白质浓度接近理论极限,浓缩的蛋白形成晶体,通过戊二醛等多功能试剂将酶永久交联,分子中静电反应和疏水反应数量增加,明显增强了蛋白质的稳定性。
交联酶晶体可用于多肽合成、酶传感器、化妆品和洗涤剂等需要高稳定性和高活性蛋白质的领域,应用前景广泛。
(2)交联酶聚集体(cleas)cleas的活性和稳定性可与clecs相媲美。
在cleas制备中,浓缩的酶蛋白会发生物理聚集而形成超分子结构,加入无机盐、有机溶剂或其他大分子试剂可使其聚集体沉淀析出,能保持酶的三维构象和活性。
再用多功能交联剂将该酶聚集体交联捆绑形成cleas。
cleas催化的高效转化率和高效可循环再利用的特点,有利于实现固定化青霉素酰化酶的工业应用价值。
3.不同菌属青霉素酰化酶的固定化条件
不同菌属所产青霉素酰化酶可能对应不同的固定化条件。
大规模生产青霉素g酰化酶的菌种有巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、埃希菌属大肠埃希菌(escherichiacoli)、雷氏普罗威登菌(providenciarettgeri)和粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)等,尤以前两种最常见。
产青霉素v酰化酶的菌种多为淡紫链霉菌(streptomyceslavendulae)、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、球形杆菌(bacillussphaericus)和气单胞菌属(aeromonas)等。
酶的固定化条件包括ph、温度、离子强度及载体性能等。
固定化时所选缓冲液的ph应与酶的等电点和载体表面所带电荷有关[27]。
当酶分子表面与载体所带电荷相反时,相互间的静电引力可使酶固定化过程加快,提高酶的负载量,缓冲液的ph应接近于酶的最适ph。
不同来源的酶分子量迥异,如大肠埃希菌青霉素g酰化酶含20.5kda的α亚基和69kda的β亚基;
球形杆菌青霉素v酰化酶分子量约为35kda[28],其中相对较小的酶分子更易包埋进载体,或吸附共价组装进介孔类载体。
常用功能性试剂修饰载体以改善其性能,优化固定效果。
chong等[29]将青霉素酰化酶吸附于不同硅烷试剂修饰的介孔载体,结果表明选用乙烯基修饰表面的介孔载体固定酶时,固定化酶相对活力达到200%。
不同菌种来源的青霉素酰化酶固定化条件的选择并未有系统的报道,也没有很强的专一性,而是根据酶本身及载体的性质创造酶固定的最适条件。
不同来源酶的固定化条件如表2所示。
本课题将巨大芽孢杆菌胞外青霉素g酰化酶(等电点7.8)溶于ph8.0的磷酸缓冲,室温组装进mcfs(平均孔径26nm)载体,制备得到性能优越的固定化酶。
4.青霉素酰化酶的固定化技术
随着载体和固定方法的发展,酶的固定化技术也有创新。
据报道,青霉素酰化酶固定化方法有常规法[34]和紫外照射法[35],脂肪酶固定化曾采用超声波法[36]。
表3比较了这几种传统固定化方法的优缺点。
本课题研究微波法固定青霉素酰化酶,采用美国cem公司mars5微波反应器,固定过程只需2min,酶负载率高达95%以上,活力回收和相对活力均远超100%。
可能因为酶蛋白和水均是极性分子,微波作用下引起剧烈的极性振荡,增加青霉素酰化酶的游离氨基与载体结合的机会,增加反应传质速率。
微波辐射提供的能量可使酶蛋白在空间结构上扭曲形成新的构象[37],共价固定化后活力中心充分暴露,酶促反应加速,固定化酶活性明显增强。
表2不同来源青霉素酰化酶的固定化条件
菌种〖〗酶ph温度载体文献fusariumoxysporum(fp941)pva7.025℃环氧丙烯聚合物[30]streptomyceslavendulae(atcc13664)pva8.0-eupergitc共价[31]bacillusmegateriumpga6.340℃添加交联剂戊二醛的mcm41[7]bacillusmegateriumpga7.8室温介孔材料sba15/130[32]escherichiacolipga8.3室温eupergitc[33]escherichiacolipga7.0-cmc[17]
表3传统固定化方法比较
分类方法优点缺点文献常规法常温摇床振荡24~72h存储稳定性好固定周期太长[34]紫外照射法
紫外照射酶与含醛基的光敏高分子混合物酶被光交联凝胶包埋,与载体骨架共价结合,提高固定化酶的稳定性扩散阻力问题,酶易失活[35]
超声波法
形成粒子的机械振动
含能量的超声振动比机械搅拌有更好促进和传质作用,提高反应速率和产率超声对酶分子产生影响
[36]
微波法
磁力搅拌下微波反应
高效,利于酶催化活力增强,降低反应活化能
微波过久破坏共价键影响酶活中心[15,37]
5.固定化青霉素酰化酶的介质工程
传统的游离状态的青霉素酰化酶通常在水相中催化,当今固定化酶催化更致力于非水相的研究。
本文重点综述了固定化青霉素酰化酶在有机相、离子液体和浊点体系中的催化性能。
5.1.有机介质
有机介质中的酶反应活性位点与水中相同,用位点专一性试剂对活性位点共价修饰,酶的催化活性消失。
由hammett效应分析和相应的线性自由焓关系(lfers)可知,有机溶剂与水溶液中酶的反应机制大致相同。
有机溶剂的物性参数为酶促反应介质的选择提供了依据,比如挥发性、分子摩尔质量、电容量(介电常数ε)、疏水性(logp)和电荷分布(偶极矩μ)等,其中logp值对酶的催化活性有影响,介电常数ε和偶极矩μ与对映选择性e有较好的相关性[38]。
有机溶剂具有增强反应物溶解度、改变化学平衡、改变酶催化微环境、增加酶的稳定性、改变酶的选择性等明显优势[39],但目前未达到产业化水平。
miguel等[40]研究固定化青霉素酰化酶在不同有机溶剂中的催化性能,醇类有乙醇、丙三醇、乙二醇等,疏质子溶剂有丙酮、dmso、dmf等,其中以乙二醇为介质的固定化酶催化性能最优。
miguel还研究不同有机介质浓度对酶催化活力的影响。
0~60%有机相中固定化酶活力高于水相,20%~40%内比活更大于200%。
fernandez等[41]研究在固定化酶过程中加入右旋葡聚糖类或聚乙烯亚胺[42]等大分子物质,改变蛋白质周围环境的亲水性,增加固定化青霉素酶的催化活性。
大分子试剂通过拥挤效应可稳定溶液酶蛋白构象[43],酶在细胞内的催化活力远远大于细胞外,可根据酶的仿生效应模拟细胞内的环境[44]。
本课题研究了固定化青霉素酰化酶在非水相中催化水解反应和大分子物质拥挤效应。
通过有机溶剂的筛选,发现在低极性的环己烷、异辛烷、石油醚
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