免疫细胞分泌研究进展Word格式文档下载.doc

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　　1单细胞分泌实时测量的新方法　　细胞分泌活动的传统研究方法主要采用ELISA、RIA、FACS等阶段性定量测定或冰冻蚀刻电镜技术、普通光学显微镜技术等形态学研究方法,都属于非现场静态研究,并且是大量细胞共同3期娄雪林等:

免疫细胞分泌研究进展生理学报ActaPhysiol&

#46;

Sin&

54卷测定。

近年来,各种实时监测技术的发展极大地促进了人们对细胞分泌机制的了解。

下面就目前常用的三种细胞分泌实时检测技术的原理、方法以及优缺点作简要介绍。

　　1&

1膜电容测量　　近10年来,膜电容检测技术在研究细胞胞吐和胞饮机制方面得到了越来越广泛的应用［1］。

细胞分泌的最后一步是囊泡膜与胞浆膜融合的过程,当分泌发生时细胞膜的表面积会增加,而细胞膜的电容大小正比于细胞膜的表面积（～1μF/cm2）,因此细胞膜电容的增加就代表细胞分泌量。

这种技术对囊泡分泌的时间分辨率极高（～ms）,常用来研究分泌事件与离子通道活动以及细胞内第二信使的关系。

最近出现的细胞贴附膜片电容技术,膜电容分辨率可达到0&

1fF,能检测到直径60nm的小囊泡分泌［2］。

这一方法为研究单个小囊泡的分泌活动如膜融合孔开闭动力学、膜融合事件的分子调控等提供了强有力的工具。

由于胞吐后囊泡膜的回收会导致膜电容的减少,因此膜电容检测技术也能提供囊泡胞饮过程的信息。

　　膜电容测量技术可用于神经细胞、内分泌细胞、免疫细胞等大多数细胞的分泌测量,而且测量精度和时间分辨率都较高,但该方法不能排除胞吞对胞吐检测的影响,并且对试验条件如封接电阻（Rm）、串联电阻（Rs）的要求很高,对于一些较复杂结构如神经轴突终末、与周边细胞有电学偶联的细胞等则不能用该技术进行研究。

2电化学测量　　用电化学技术监测细胞分泌的原理是:

在电极尖端表面施加一定的电压,容易氧化的化学信使物质就会在电极尖端释放出电子而发生氧化,电极可获得电子并产生一定的电流［3］。

微电极的电流大小与电极尖端面积和实验类型有关,一般在pA到nA范围,通常采用膜片钳放大器等低噪声仪器进行检测。

对单个分泌电流峰积分即可估算出每个囊泡中包含的递质分子数,即量子包装的大小。

施加的电压可为恒电位或三角波循环电压,前者的优点是时间分辨率高,后者的优点是能区分不同的信息分子。

在单细胞胞吐测量时两种方法可以互相补充。

目前儿茶酚胺、5-HT、胰岛素、组胺、nO以及含色氨酸或酪氨酸残基的多肽激素或递质都可直接或间接地使用该方法检测［16］。

[!

--empirenews.page--]　　电化学技术监测分泌的最大优点是时间分辨率高（ms级）,能监测单个囊泡的释放以及囊泡中的递质含量,且较膜电容测量更为直观;

其次具有一定的细胞空间分辨率,可用于测定细胞释放热区（hotspot）;

另外,该方法对细胞无损伤,可进行长时间监测。

但是电极只能检测到少部分信息物质（10％左右）,而且对于那些不能被氧化的物质的释放不能直接检测［16］。

本方法常与膜电容方法联合应用来研究分泌事件,以相互补充。

3细胞分泌的光学测量　　用普通光学显微镜只能检测巨大囊泡的分泌过程,而新的荧光染料的开发和显微成像技术的发展使实时监测小囊泡的分泌成为可能［4］。

FM1-43和FM4-64等是有效的研究分泌活动的选择性膜表面荧光标记物,它们在水相中没有荧光,当它们插入脂质膜后则显示较强的荧光,囊泡膜胞吐后会使细胞表面荧光增加,而胞吞回收的囊泡因吞进细胞周围的染料而被荧光标记,这样便能够实时观察细胞的胞吐及胞吞过程。

本方法的缺点是背景荧光较大,fM染料目前尚不能用于脑片等组织切片的分泌研究。

另一种方法是通过基因转染方法将荧光基因如绿色荧光蛋白（GFP）基因转入靶细胞中并选择性地在囊泡中表达,然后用激光扫描共聚焦荧光显微镜等检测囊泡的运动过程［5］。

例如,将GFP基因与囊泡特异的前胰岛素基因整合后转入胰岛INS-1β-细胞中进行表达,然后用荧光成像技术实时研究活分泌囊泡的转移、锚定和胞吐过程。

此外还有免疫荧光标记法:

多巴胺β羟化酶（DBH）在嗜铬细胞分泌囊泡中是一种主要的膜蛋白,由于它在胞吐中会出现在细胞膜的表面,随着它与胞外液中荧光标记的DBH抗体的结合,就能观察到胞吐位点在细胞膜上的分布以及囊泡膜的回收过程。

1&

4胞内信号分子光解方法　　细胞分泌活动受很多因素的调控,采用信使物质瞬时释放的方法［6］,可以定量研究各因素对分泌的影响。

神经递质的分泌与细胞钙离子浓度紧密偶联（与钙离子浓度的3～4次方成正相关）。

Ca2＋螯合物DM-nitrophen和NitrophenyleGTA可用于快速而均匀地提升细胞内钙离子浓度,将这些物质与Ca2染料通过膜片钳电极或孵育的方法导入细胞内,然后经高能量的紫外光激发,便能产生一个迅速的、阶跃性的钙升高,并且整个细胞钙浓度都会均一地升高。

这克服了单纯电刺激引起的离子通道附近产生不同的钙微区的缺点。

DM-nitrophen在光解前对Ca2有很高的亲和力,对静息的细胞钙缓冲几乎没有影响,是研究细胞钙缓冲和钙稳态系统的非常理想的材料。

通过控制激发紫外光的强度,可以用来进行细胞内钙离子浓度滴定,也可用于钙结合力测定以及其他许多钙依赖的细胞功能活动。

但是它易受Mg2结合的影响。

而NitrophenylEGTA对Ca2有更高的选择性,但它在光解前对Ca2亲和力较低,且不易被光解产生大的Ca2阶跃。

除了Ca2外,许多第二信使如cAMP等都可用该方法对其细胞内浓度进行精确控制。

　　2免疫细胞分泌的细胞和分子机制　　2&

1免疫细胞的离子通道和细胞功能　　免疫细胞不属于可兴奋性细胞（如神经细胞、肌肉细胞等）之列,但也具有某些与神经细胞相类似的电生理特性。

离子通道的活动与离子跨膜流动、膜电位的变化以及随后的淋巴细胞激活密切相关。

在大多数淋巴细胞上存在有不同的离子通道,这些离子通道类似于神经细胞以及肌肉细胞的离子通道,但又有其自身的特点。

Na通道仅存在于少数T细胞、T细胞株和自然杀伤细胞。

电压依赖性K通道存在于大多数T淋巴细胞、T淋巴细胞株和巨噬细胞［7］,类似于神经细胞上的延迟整流K通道特性。

根据其电压激活和灭活的动力学特性以及药理学特征可分为3种亚型,它们随细胞的发育状态和功能分类不同而有所变化,可能与细胞有丝分裂有关。

丝裂酶原刺激后24h可使K电流增大;

K通道阻断剂则能剂量依赖性地抑制有丝分裂和抗原引发的淋巴细胞的激活,可能是“K通道开放-细胞膜去极化-Ca2通道开放”通路被抑制后细胞外Ca2内流减少所致［8］。

Ca2激活的K通道K（Ca）则由丝裂酶原引起的细胞Ca2浓度升高激活,进而引发K外流和细胞膜的超极化。

电压依赖性Ca通道仅在B淋巴细胞上存在,而在T淋巴细胞以及T淋巴细胞株均未见报道;

但T淋巴细胞上存在一种非电压依赖性的Ca2通道,由T细胞抗原所激活,然后通过第二信使IP3,引发细胞内Ca2库释放,增强Ca2离子跨膜内流或Ca2依赖性灭活。

--empirenews.page--]　　目前,Ca2作为细胞内较早激活的一个重要的第二信使已被接受,但其后续信号过程尚不清楚。

T细胞的Ca2信号可分成两相:

快速的Ca2峰和随后的Ca2平台,前者由细胞内钙库的释放引起,后者则由CRAC引发的持续跨膜Ca2内流引起。

单细胞上的钙信号可表现为反复的钙振荡,这可能是一种通过频率编码来传递信息的方式。

钙信号的频率特性可通过几种非线性反馈系统来调控,如PKC介导的CD3γ亚基的磷酸化负反馈（可反馈抑制TCR/CD3的功能）、ca2信号放大正反馈（内质网Ca2的释放和同时发生的CRAC以及PLC的进一步激活）、ca2离子的自身负反馈。

关于G蛋白是否介导“TCR/CD3-PI水解-Ca2动员”信号通路,尚是一个悬而未决的问题,一些间接证据表明T细胞的激活需要G蛋白的参与,TCR/CD3可能在结构上形成G蛋白偶联受体［9］。

联合应用膜片钳技术、单细胞荧光测量以及报告基因（如GFP、rFP）等研究方法,有望阐明免疫细胞的信号转导、淋巴因子的分泌机制和其他相关的细胞功能。

　　2&

2免疫细胞分泌抗体或细胞因子的研究　　经过适当处理,免疫细胞可应用膜片钳测量细胞膜电容。

膜电容正比于细胞膜表面积。

当分泌小泡与细胞膜溶合并胞吐时,便伴有膜电容的增加。

人的中性粒白细胞是成功应用whole-cell和on-cell膜片钳法进行研究的少数免疫细胞之一［10］。

通过膜片钳电极向细胞内导入GTPγS,可引起膜电容从静息时的3pF增加到8～9pF。

有趣的是虽然GTPγS导入可引起暂时的Ca2浓度升高和膜电容的增加,但当加入高浓度的Ca2缓冲物质将钙升高阻断后,膜电容的升高依然存在而不受Ca2离子的影响,表明GTPγS引起的分泌不需要Ca2离子的参与,属于Ca2非依赖性分泌,这与经典的Ca2依赖性分泌明显不同。

进一步研究Ca2和GTPγS的促分泌效率的差别和他们分别在什么情况下起作用将是一个重要课题。

当向细胞导入高浓度Ca2时,分泌过程呈现2种不同的动力学成分,第一相只需要1～10μmol/L的Ca2,而第二相则需要100～300μmol/L的Ca2浓度,他们分别对应免疫细胞内不同性质的囊泡,即不同的Ca2浓度控制不同的囊泡分泌,以适应不同的细胞功能。

　　lollike等［2］应用细胞贴附式膜片钳技术在中性粒白细胞研究了免疫细胞脱颗粒的动力学,包括单个囊泡融合的动力学特性,用这种方法,他们可以分辨出1fF的阶梯状电容变化（对应单个囊泡分泌事件）。

在形成封接后,他观察到一种自发的阶梯状膜电容降低,代表直径60～165nm的囊泡小泡的内吞。

当用Ionomycin刺激后,可观察到0&

1~5fF大小不等的阶梯状电容升高,代表了白细胞不同类型囊泡的分泌（图2）。

对于直径＞180nm的囊泡可以直接观察到单个融合孔活动,融合孔起始平均电导为150pS,最小的仅有35pS,随后融合孔逐渐扩大,扩展速度有快有慢,与报道的巨大的囊泡融合孔特性类似。

这是首次直接观察到直径＜500nm的小囊泡的融合孔,根据其起始电导小的特征,可以推测融合孔的形成必须有蛋白质参与。

免疫细胞融合孔也存在闪烁开闭（flicker）的现象［11,12］,这表明小囊泡