蛋白质组学实验方法_精品文档文档格式.doc

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尿素5M3.0g

SB3-102%0.2g

分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液母液

尿素6M36g

SDS2%2g

Tris-HCl0.05MpH8.83.3ml（1.5MpH8.8Tris-HCl）

甘油20％20ml

MilliQ水定容至100ml

分装成10管，-20℃冰箱保存。

胶条平衡缓冲液Ⅰ

胶条平衡缓冲液母液10ml

DTT0.2g

充分混匀，用时现配。

胶条平衡缓冲液Ⅱ

碘乙酰胺0.25g

低熔点琼脂糖封胶液

低熔点琼脂糖0.5％0.5g

Tris25mM0.303g

甘氨酸192mM1.44g

SDS0.1%1ml（10%SDS）

溴酚蓝0.001％100μl（1%溴酚蓝）

MilliQ水定容至100ml

加热溶解至澄清，室温保存。

30％聚丙烯酰胺贮液

丙烯酰胺150g

甲叉双丙稀酰胺4g

MilliQ水500ml

滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。

1.5mol/LTris碱pH8.8

Tris碱90.75g

MilliQ水400ml

用1mol/LHCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml,4℃冰箱保存。

10%SDS

SDS10g

MilliQ水100ml

10%过硫酸铵

过硫酸铵0.1g

MilliQ水1ml

现用现配。

10×

电泳缓冲液

（1×

＝25mMTris,192mMglycine,0.1%SDS,pH8.3）

Tris碱30g

甘氨酸144g

SDS10g

MilliQ水1L

混匀后，室温保存。

2．2操作步骤

2.2.1第一向等电聚焦

1.从冰箱中取水化上样缓冲液，室温溶解；

在enpendoff管中，2.0mg蛋白干粉加入200μl水化上样缓冲液，室温下裂解3-4h；

10000rpm常温离心10min,取上清液上样水化。

具体的上样体积及蛋白质上样量如下表，

ReadyStripTMIPG胶条长度

上样体积

分析型的上样量

（银染）

制备型的上样量

（考马斯亮兰染色）

7cm

125-250μl

10-100ug

200-500ug

17cm

300-600μl

100-300ug

1-3mg

2.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，于室温放置10min。

3.沿着聚焦盘的边缘由左至右线性加入样品。

在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品一定要连贯，同时注意不要产生气泡。

4.用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层，分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品溶液上，使得胶条得正极对应于聚焦盘得正极。

确保胶条与电极紧密接触，同时不要使胶条下面的溶液产生气泡。

5.在每根胶条上覆盖矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

6.对好正、负极，盖上盖子。

设置等电聚焦程序。

7cm胶条

水化12h（17-20℃）主动水化

S1250V慢速2h除盐

S2500V慢速1h除盐

S31000V快速1h除盐

S44000V线性3h升压

S54000V快速25000伏h聚焦

S6500V快速任意时间保持

17cm胶条

水化12h（17-20℃）主动水化

S1250V慢速2h除盐

S2500V慢速1h除盐

S31000V快速1h除盐

S48000V线性5h升压

S58000V快速60,000伏h聚焦

S6500V快速任意时间保持

l选择所放置的胶条数。

l设置每根胶条的极限电流。

l设置等电聚焦时的温度。

7.聚焦结束的胶条如不立即进行平衡、第二向SDS－PAGE电泳，可将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存1-2天。

2.2.2第二向SDS－PAGE电泳

1.配制12％的丙稀酰胺凝胶，上部留0.5cm的空间，用MilliQ水封面，保持胶面平整。

待凝胶凝固候，倒去分离胶表面的MilliQ水，再用MilliQ水冲洗。

2.从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10min，使其溶解。

3.在桌上先放置干得厚滤纸，聚焦好得胶条胶面朝上放在干得厚滤纸上。

将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后置于胶条上，轻轻吸干胶条上得矿物油及多余样品。

这可以减少凝胶染色时出现得纵条纹。

4.将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在槽中加入平衡缓冲液Ⅰ。

将样品水化盘放在摇床上缓慢摇晃10-15min。

5.第一次平衡结束后，彻底倒掉平衡缓冲液Ⅰ，将胶条竖在滤纸上，吸去多余得平衡液。

再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续在摇床上缓慢摇晃10-15min。

6.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余得液体。

将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板再下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。

7.第二次平衡结束后，用滤纸吸去胶条上多余的平衡液。

用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×

电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。

8.将放有胶条的SDS－PAGE凝胶转移到灌胶架上，短板一面对着自己，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

9.用镊子或平头的针头轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺胶胶面完全接触。

注意不要在胶条下方产生任何气泡，同时操作时注意不要碰到胶面。

10.放置5min，低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。

11.电泳起始时用低电流（7cm胶条：

5-10mA/gel；

17cm胶条：

10mA/gel）或低电压（7cm胶条：

50-75V/gel；

17cm胶条75-100V/gel），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，在加大电流（7cm胶条：

10-15mA/gel；

20-30mA/gel）或电压（7cm胶条：

150-200V/gel；

300-400V/gel），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

12.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以做记号。

然后进行染色。

2．3染色方法

2.3.1考马斯亮蓝G-250染色

固定液：

45％（V/V）甲醇，1％（V/V）乙酸

G-250染色液：

17％（W/V）硫酸铵，34％（