模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定_精品文档Word格式.doc
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每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。
DNA经EB染色,EB可与核酸结合,在紫外光激发下产生荧光。
现广泛应用于核酸的研究中。
引言
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物细胞时,该DNA区段能自发转移进植物细胞,并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
将Ti质粒进行改造,将感兴趣的基因放进T-DNA区段中,通过农杆菌侵染植物细胞,实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插入基因内部导致基因突变:
T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部,特别是插入到外显子区,将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞,是获得植物突变体的一种重要方法。
农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有感染能力。
这使农杆菌Ti质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。
反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体,建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。
其中,“三引物法”是主要鉴定方法之一。
“三引物法”即采用三个引物(LP、RP、BP)进行PCR扩增。
野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入,所以其PCR扩增产物仅有1种,电泳结果为一条大带(由LP+RP这一对引物扩增出来);
纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入,也只能得到1种PCR扩增产物,电泳结果为一条小带(由BP+RP这一对引物扩增出来);
杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入,所以PCR扩增产物有2种,电泳结果为一条大带由(LP+RP这一对引物扩增出来)和一条小带(由BP+RP这一对引物扩增出来)。
电泳结果差异明显,能有效区插入突变体的类型。
此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。
本方法操作简单,成功率高,结果可靠,适用于从大量拟南芥T—DNA插入突变体中快速鉴定出突变体。
【实验材料】
1.试剂:
液氮,2*CTAB提取液,氯仿-异戊醇(24:
1),无水乙醇,70%乙醇,TE,PCR反应体系(DNA模板(基因组DNA),引物LP、RP、BP,缓冲液,MgCl2,dNTPmixture,ddH2O,Taq酶),琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖,1×
TAE缓冲液,Loadingbuffer,DL2,000DNAMarker,λ-HindⅢDNAdigestMarker,溴化乙锭。
2.器具:
1.5ml离心管,水浴锅,微量移液器,离心机,PCR仪,微波炉,电泳仪,电泳槽,梳子,三角瓶,微量天平,手套,染色盘,凝胶成像仪。
3.材料:
拟南芥T-DNA插入突变体植株。
【实验步骤】
提取拟南芥基因组DNA
1.在1.5ml离心管中放入2或3片拟南芥幼嫩叶片,用液氮将其研磨成细粉,向管中加入600ul预热至65℃的2×
CTAB提取液,轻摇混匀。
2.65℃水浴30min,其间轻摇混匀。
3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24:
1),室温下轻轻混匀10min,12000rpm离心15min,再转移上清入新管。
4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇,小心混匀,-20℃下30min,12000rpm离心15min,弃上清。
5.用70%乙醇洗涤沉淀一次,12000rpm稍离心,弃上清。
6.将沉淀晾干,加20-50ulTE(pH8.0),65℃水浴30min溶解DNA。
PCR
取3个PCR小管(一个为三引物体系,另外两个为双引物体系),按照如下反应体系向PCR小管内加入样品,设定如下反应程序,进行PCR。
反应体系:
三引物反应体系25ul体系
双引物反应体系25ul体系
H2O
15ul
16ul
10xTaqbuffer(MgCl2free)
2.5ul
10xTaqbuffer(MgCl2free)
MgCl2(25mM)
2ul
引物LP(10uM)
1ul
引物LP或BP(10uM)
引物RP(10uM)
引物RP(10uM)
引物BP(10uM)
dNTP(各2.5mM)
0.5ul
模板DNA(30-50ng/μl)
Taq酶(5U/μl)
0.2ul
反应程序
预变性94℃5min
变性94℃40sec
退火53℃50sec
延伸72℃80sec
循环35次
72℃10min
琼脂糖凝胶电泳
注:
①电泳这一步骤,我与其余五名同学共同完成,共用同一块胶板。
②基因组DNA的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为0.8%,PCR产物的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为2%。
1.制胶:
称取0.24g琼脂糖,加入30mlTAE缓冲液(用于基因组DNA的电泳);
另称取1.60g琼脂糖,加入80mlTAE缓冲液(用于PCR产物的电泳)。
放入微波炉中加热溶化。
2.灌胶:
待胶冷至50-60℃时,缓缓倒入胶板。
约半个30—40min后,胶已凝固,拔去梳子,将胶板放在电泳槽中,补充槽内TAE缓冲液,至约高出胶板1mm。
3.加样:
将样品与Loadingbuffer在封口膜上混匀,用微量移液器将样品加入到点样孔内。
(基因组DNA加样量为5ul,PCR产物加样量为20ul)
4.电泳:
接通导线(加样端接负极),调节电压至5v/cm,当指示剂距胶板底部1-2cm时,停止电泳。
5.染色:
将胶板放入含EB的染色盘中,染色约10min,再将胶板转移到清水中清洗。
6.观察:
将凝胶放入凝胶成像仪内观察、拍照。
【实验结果】
理论上,电泳结果图上会出现一条大带或一条小带或两条带同时出现,并且可以对T-DNA插入突变体的类型做出准确鉴定。
各种可能的电泳结果对应插入突变的类型如下表:
电泳条带的有无
鉴定结果
1000-1500bp间
800-900bp间
有
无
野生型
插入杂合突变体
插入纯合突变体
但是由于多种可能,最终基因组DNA和PCR扩增产物的电泳结果都没有出现预期条带。
对这一现象出现的原因分析如下:
由于班里大多数同学出现了同样的情况,只有极少数同学的电泳结果图上出现了条带,基本可以断定并非由实验操作造成。
4
【注意事项】
1.实验取材为植株叶片,而不要将植株连根拔起。
否则的话即便检测出实验材料为插入纯合突变体,由于植株已经不存在,实验结果就没有了意义。
2.液氮研磨实验材料时,注意不要将液氮倒在手上,以免将皮肤冻伤。
3.配制PCR反应体系时由于各种试剂量较少,要靠壁滴加。
4.在用微波炉加热溶解琼脂糖的过程中,TBE缓冲液中的水分会蒸发掉一少部分,所以,最好在加热前在三角瓶内补充少量蒸馏水。
5.注意电泳方向,点样孔所在方向对准电泳槽的负极(DNA带负电荷,在电泳的过程中向正极移动)。
6.EB为强诱变剂,染色时要佩戴手套,实验技术后认真清洗双手。
参考文献
[1]模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定.ppt
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