实验35过氧化氢酶的活性测定_精品文档Word格式文档下载.doc
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7个,离心管5ml×
8支;
离心机;
分光光度计。
【试剂】
100μmol/LH2O2丙酮试剂:
取30%分析纯H2O257μl,溶于100ml,再稀释100倍;
2mol/L硫酸;
5%(W/V)硫酸钛;
丙酮;
浓氨水。
【方法】
1.制作标准曲线:
取10ml离心管7支,顺序编号,并按表40-1加入试剂。
表40-1测定H2O2浓度标准曲线配置表
试剂(ml)
离心管号
1
2
3
4
5
6
7
100μmol/LH2O2
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
4℃下预冷丙酮
0.9
5%硫酸钛
浓氨水
3000r/min离心10min,弃去上清夜,留沉淀
2mol硫酸
5.0
待沉淀完全溶解后,将其小心转入10ml容量瓶中,并用蒸馏水少量多次冲洗离心管,将洗涤液合并后定容至10ml刻度,415nm波长下比色。
2.样品提取和测定:
(1)称取新鲜植物组织2~5g(视H2O2含量多少而定),按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后,转入离心管3000r/min下离心10min,弃去残渣,上清液即为样品提取液。
(2)用移液管吸取样品提取液1ml,按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后3000rpm/min离心10min,弃去上清液。
沉淀用丙酮反复洗涤3~5次,直到去除植物色素。
(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解后,与标准曲线同样的方法定容并比色。
3.结果计算:
植物组织中H2O2含量(μmol/gFw)=
式中C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度(μmol);
Vt—样品提取液总体积(ml);
V1—测定时用样品提取液体积(ml);
FW—植物组织鲜重(g)。
二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法
【原理】
过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
2e-
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH-)
2e-
R(Fe+3OH-)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2
据此,可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2
5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】
三角瓶50ml×
4;
酸式滴定管(10ml);
恒温水浴;
容量瓶25ml×
1。
【试剂】
10%H2SO4;
0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8;
0.1mol/L高锰酸钾标准液:
称取KMnO4(AR)3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml,用0.1mol/L草酸溶液标定;
0.1mol/LH2O2:
市售30%H2O2大约等于17.6mol/L,取30%H2O2溶液5.68ml,稀释至1000ml,用标准0.1mol/KMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定;
0.1mol/L草酸:
称取优级纯H2C2O4·
2H2O12.607g,用蒸馏水溶解后,定容至1L。
【方法】
1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25ml容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转入容量瓶中,用同一缓冲液定容,4000rpm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个(两个测定两个对照),测定瓶中加入酶液2.5ml,对照瓶中加入煮死酶液2.5ml,再加入2.5ml0.1mol/LH2O2,同时计时,于30℃恒温水浴中保温10min,立即加入10%H2SO42.5ml。
3.用0.1mol/LKMnO4标准溶液滴定H2O2,至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。
4.结果计算:
酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示:
酶活(mgH2O2/gFW·
min)=
式中A—对照KMnO4滴定毫升数;
B—酶反应后KMnO4滴定毫升数;
VT—酶液总量(ml);
V1—反应所用酶液量(ml);
W—样品鲜重(g);
1.7—1ml0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mgH2O2。
【注意】
所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。
三、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】
紫外分光光度计;
250ml容量瓶1个;
0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支;
10ml试管3支;
0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮);
0.1mol/LH2O2(用0.1mol/L高锰酸钾标定)。
1.酶液提取:
称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2~3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.测定:
取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表40-2顺序加入试剂。
表40-2紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管号
S1
S2
S3
粗酶液(ml)
pH7.8磷酸(ml)
1.5
蒸馏水(ml)
25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性。
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中A240=AS0-
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值;
AS1,AS2—样品管吸光值;
Vt—粗酶提取液总体积(ml);
V1—测定用粗酶液体积(ml);
FW—样品鲜重(g);
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u);
t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
【注意事项】
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
【思考题】
1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?
2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
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