二代测序流程_精品文档Word下载.docx
- 文档编号:13877863
- 上传时间:2022-10-14
- 格式:DOCX
- 页数:4
- 大小:781.94KB
二代测序流程_精品文档Word下载.docx
《二代测序流程_精品文档Word下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《二代测序流程_精品文档Word下载.docx(4页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
flowcell:
是指Illumina测序时,测序反应发生的位置,1个flowcell含有8条lane
lane:
每一个flowcell上都有8条泳道,用于测序反应,可以添加试剂,洗脱等等 tail:
每一次测序荧光扫描的最小单位
reads:
指测序的结果,1条序列一般称为1条reads
bp:
basepair碱基对,用于衡量序列长度
双端测序:
是指一条序列可能比较长,如500bp,我们可以两端各测150bp
junction:
在进行双端测序时,中间会留有200bp测不到的东西,我们称其为junction
adapter:
就是在测序时需要的一段特定的序列,有类似于引物的功能
primer:
PCR中的引物
测序反应基本流程介绍:
1、建库
A、将基因组DNA用超声波打断(由于Illumina测序策略本身的问题,导致其测序长度不可能太长,目前最好的XTen测序仪也就只能双端各测150bp,所以不可能直接拿整个基因组去测序,因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段,这个根据需要使用不同的策略,一般测人的基因组,我们是先将其打断成300-500bp长度的片段,这个是根据跑胶控制的)
B、打断以后会出现末端不平整的情况,用酶补平,所以现在的序列是平末端
C、完成补平以后,在3'
端使用酶加上一个特异的碱基A
D、加上A之后就可以利用互补配对的原则,添加adapter,这个adpater可以分成两个部分,一部分是测序的时候需要使用的引物序列,另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列
E、进行PCR扩增,使得DNA样品浓度能够满足上机要求
建库示意图如下:
2、桥式PCR
A、将上述的DNA样品调整到合适的浓度后加入到flowcell中,从而序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过互补配对结合,如下图:
图中不同的颜色表示的是两种不同的adpater,分别对应序列之前加入的两种adpater
B、连接以后就可以正式开始桥式PCR了。
首先进行第一轮扩增,将序列补成双链。
加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链,并洗脱
C、加入缓冲液,使其反应环境变成中性,这时序列自由端的部分就会和旁边的adpater进行匹配
D、进行下一轮PCR,在PCR的过程中,序列弯成桥状,所以叫桥式PCR,一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍
E、如此循环下去,就会得到一个具有完全相同序列的簇,一般叫做cluster
3、测序
测序的过程反而简单了不少。
就是来一个primer,然后加入特殊处理过的A,T,C,G四种碱基。
特殊的地方有两点,一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基,保证每次只能够在序列上添加1个碱基;
另一方面是,碱基部分加入了荧光基团,可以激发出不同的颜色
在测序过程中,每1轮测序,保证只有1个碱基加入的当前测序链。
这时候测序仪会发出激发光,并扫描荧光。
因为一个cluster中所有的序列是一样的,所以理论上,这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致
随后加入试剂,将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH,然后切掉部分荧光基团,使其在下一轮反应中,不再发出荧光。
如此往复,就可以测出序列的内容
Illumina测序会有长度限制的原因:
1、测序时,经过长时间的PCR,会有不同步的情况。
通俗一点讲就是,比如一开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链,但是经过1轮增加碱基,其中99个都加入了1个碱基,显示了红色,另外1个没有加入碱基,不显示颜色。
这时候整体为红色,我们可以顺利得到结果。
随后,在第2轮再加入碱基进行合成的时候,就变成了,之前没有加入的加入了1个碱基显示红色,剩下的99个显示绿色,这个时候就会出现杂信号。
当测序长度不断延长,这个杂信号会越来越多,最后很有可能出现,50个红,50个绿色,这时候我们判断不出来到底是什么碱基被合成
2、测序过程中,使用的碱基是特殊处理的,有一个非常大的荧光基团修饰。
在使用DNA聚合酶的时候,酶的状态也会受到底物的影响,越来越差
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 二代 流程 精品 文档