一次性使用卫生用品产品微生物检测方法_精品文档Word格式文档下载.doc
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如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时,稀释液量可按每次50mL递增,直到能吸出足够测试用样液。
在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时应调整稀释度。
B2细菌菌落总数与初始污染菌检测方法
本方法适用于产品初始污染菌与细菌菌落总数(以下统称为细菌菌落总数)检测。
B2.1操作步骤
待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数。
共接种5个平皿,每个平皿中加入1mL样液,然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基15~20mL倒入每个平皿内混合均匀。
待琼脂凝固后翻转平皿置35℃±
2℃培养48h后,计算平板上的菌落数。
B2.2结果报告
菌落呈片状生长的平板不宜采用;
计数符合要求的平板上的菌落,按式(B1)计算结果:
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式中:
X1――细菌菌落总数,cfu/g或cfu/mL;
A――5块营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数;
K――稀释度。
当菌落数在100以内,按实有数报告,大于100时采用二位有效数字。
如果样品菌落总数超过本标准的规定,按B2.3进行复检和结果报告。
B2.3复检方法
将留存的复检样品依前法复测2次,2次结果平均值都达到本标准的规定,则判定被检样品合格;
其中有任何1次结果平均值超过本标准规定,则判定被检样品不合格。
B3大肠菌群检测方法
B3.1操作步骤
取样液5mL接种50mL乳糖胆盐发酵管,置35℃±
2℃培养24h,如不产酸也不产气,则报告为大肠菌群阴性。
如产酸产气,则划线接种伊红美蓝琼脂平板,置35℃±
2℃培养18~24h,观察平板上菌落形态。
典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,常具有金属光泽,也有的呈紫黑色,不带或略带金属光泽,或粉红色,中心较深的菌落。
取疑似大肠菌落1~2个作革兰氏染色镜检,同时接种乳糖发酵管,置35℃±
2℃培养24h,观察产气情况。
B3.2结果报告
凡乳糖胆盐发酵管产酸产气,乳糖发酵管产酸产气,在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落,革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌,可报告被检样品检出大肠杆菌。
B4绿脓杆菌检测方法
B4.1操作步骤
取样液5mL,加入到50mLSCDLP培养液中,充分混匀,置35℃±
2℃培养18~24h.如有绿脓杆菌生长,培养液表面呈现一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
从培养液的薄菌膜处挑取培养物,划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板,置35℃±
2℃培养18~24h,观察菌落特征。
绿脓杆菌在此培养基上生长良好,菌落扁平,边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色,其他菌不长。
取可疑菌落涂片作革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性菌者应进行下列试验:
氧化酶试验:
取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液,30s内出现粉红色或紫红色,为氧化酶试验阳性,不变色者为阴性。
绿脓菌素试验:
取2~3个可疑菌落,分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面,35℃±
2℃培养24h,加入三氯甲烷3~5mL,充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解,待三氯甲烷呈蓝色时,用吸管移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL,振荡后静置片刻。
如上层出现粉红色或紫红色即为阳性,表示有绿脓菌素存在。
硝酸盐还原产气试验:
挑取被检菌纯培养物接种在硝酸盐胨水培养基中,置35℃±
2℃培养24h,培养基小倒管中有气者即为阳性。
明胶液化试验:
取可疑菌落纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置35℃±
2℃培养24h,取出放于4~10℃,如仍呈液态为阳性,凝固者为阴性。
42℃生长试验:
挑取可疑培养物,接种在普通琼脂斜面培养基上,置42℃培养24~48h,有绿脓杆菌生长为阳性。
B4.2结果报告
被检样品经增菌分离培养后,证实为革兰氏阴性杆菌,氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者,即可报告被检样品中检出绿脓杆菌。
如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时,仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。
B5金黄色葡萄球菌检测方法
B5.1操作步骤
2℃培养24h.
自上述增菌液中取1~2接种环,划线接种在血琼脂培养基上,置35℃±
2℃培养24~48h.在血琼脂平板上该菌菌落呈金黄色,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,周围有溶血圈。
挑取典型菌落,涂片作革兰氏染色镜检,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列成葡萄状,无芽胞与荚膜。
镜检符合上述情况,应进行下列试验:
甘露醇发酵试验:
取上述菌落接种甘露醇培养液,置35℃±
2℃培养24h,发酵甘露醇产酸者为阳性。
血浆凝固酶试验:
玻片法:
取清洁干燥载玻片,一端滴加一滴生理盐水,另一端滴加一滴兔血浆,挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合,5min如血浆内出现团块或颗粒状凝块,而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固则为阳性,如两者均无凝固则为阴性。
凡盐水滴与血浆滴均有凝固现象,再进行试管凝固酶试验;
试管法:
吸取1∶4新鲜血浆0.5mL,放灭菌小试管中,加入等量待检菌24h肉汤培养物0.5mL.混匀,放35℃±
2℃温箱或水浴中,每半小时观察一次,24h之内呈现凝块即为阳性。
同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物各0.5mL作阳性与阴性对照。
B5.2结果报告
凡在琼脂平板上有可疑菌落生长,镜检为革兰氏阳性葡萄球菌,并能发酵甘露醇产酸,血浆凝固酶试验阳性者,可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。
B6溶血性链球菌检测方法
B6.1操作步骤
取样液5mL加入到50mL葡萄糖肉汤,35℃±
将培养物划线接种血琼脂平板,35℃±
2℃培养24h观察菌落特征。
溶血性链球菌在血平板上为灰白色,半透明或不透明,针尖状突起,表面光滑,边缘整齐,周围有无色透明溶血圈。
挑取典型菌落作涂片革兰氏染色镜检,应为革兰氏阳性,呈链状排列的球菌。
链激酶试验:
吸取草酸钾血浆0.2mL(0.01g草酸钾加5mL兔血浆混匀,经离心沉淀,吸取上清液),加入0.8mL灭菌生理盐水,混匀后再加入待检菌24h肉汤培养物0.5mL和0.25%氯化钙0.25mL,混匀,放35℃±
2℃水浴中,2min观察一次(一般10min内可凝固),待血浆凝固后继续观察并记录溶化时间。
如2h内不溶化,继续放置24h观察,如凝块全部溶化为阳性,24h仍不溶化为阴性。
杆菌肽敏感试验:
将被检菌菌液涂于血平板上,用灭菌镊子取每片含0.04单位杆菌肽的纸片放在平板表面上,同时以已知阳性菌株作对照,在35℃±
2℃下放置18~24h,有抑菌带者为阳性。
B6.2结果报告
镜检革兰氏阳性链状排列球菌,血平板上呈现溶血圈,链激酶和杆菌肽试验阳性,可报告被检样品检出溶血性链球菌。
B7真菌菌落总数检测方法
B7.1操作步骤
待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作真菌计数,共接种5个平皿,每一个平皿中加入1mL样液,然后用冷却至45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基15~25mL倒入每个平皿内混合均匀,琼脂凝固后翻转平皿置25℃±
2℃培养7天,分别于3、5、7天观察,计算平板上菌落数,如果发现菌落蔓延,以前一次的菌落计数为准。
B7.2结果报告
菌落呈片状生产的平板不宜采用;
计数符合要求的平板上的菌落,按式(B2)计算结果:
X2――真菌菌落总数,cfu/g或cfu/mL;
B――5块沙氏琼脂培养基平板上的真菌菌落总数;
如果样品菌落总数超过本标准的规定,按B7.3进行复检和结果报告。
B7.3复检方法
将留存的复检样品依前法复测2次,2次结果都达到本标准的规定,则判定被检样品合格,其中有任何1次结果超过本标准规定,则判定被检样品不合格。
B8真菌定性检测方法
B8.1操作步骤
取样液5mL加入到50mL沙氏培养基中,25℃±
2℃培养7天,逐日观察有无真菌生长。
B8.2结果报告
培养管混浊应转种沙氏琼脂培养基,证实有真菌生长,可报告被检样品检出真菌。
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