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扩增片段长度为409bp。
以沉积物总DNA为模板,用甲烷菌特异性引物进行PCR反应。
PCR反应体系为(50μL):
10×
buffer(含Mg2+)5μL
dNTP(2.5mmol/L)4μL
上、下游引物(10μmol/L)1μL
ExTaq酶(5U/μL)0.35μL
DNA模板(10ng/μL)1μL
ddH2O37.65μL
PCR循环参数:
95°
C预变性3min;
接着30个循环为95°
C变性30s,55°
C低温退火45s,72°
C延伸30s;
72°
C延伸10min,4°
C保温。
(3)重组标准质粒的制备
按照琼脂糖凝胶DNA片段回收纯化试剂盒说明对PCR产物进行纯化、回收。
按照pMD19-T载体试剂盒的说明书将纯化的PCR产物与pMD19-T载体连接。
连接体系为:
1.2μL水,0.8μLPCR产物,0.35μLpMD19-T载体,2.5μLSolutionⅠ(注:
按顺序添加,并在冰上操作),于16℃过夜反应(放PCR仪上)。
转化:
①把感受态细胞(E.coliCompetentCells)置于冰中融化;
②把25μL的感受态细胞移至灭菌处理的离心管内;
③加入用于转化的DNA(10ng以下);
④冰中放置30min;
⑤42°
C放置60s;
⑥冰中放置2-3min;
⑦加入37°
C预温好的LB培养基250μL;
⑧37°
C振荡培养1h(160-225rpm);
⑨取适量涂布琼脂平板培养基(160μL)(先涂150μLAmp,干后用前涂80μLX-gal);
⑩37°
C过夜培养,直至可观察到菌落为止;
挑选单个白色菌斑至3mL含Amp的LB培养基,37°
C摇菌培养,直至培养液变浑浊。
分别以原有PCR引物(mlas和mcrA-rev)和M13(M13R和M13F)引物对菌液进行扩增,根据扩增特异条带的位置鉴定阳性克隆,抽提两种引物扩增均为阳性的样品,按照质粒DNA提取试剂盒的操作要求提取质粒DNA。
以M13为引物的PCR反应体系为(20μL):
buffer2μL
Mg2+1.2μL
dNTP1.2μL
上、下游引物0.3μL
RTaq酶0.2μL
DNA模板0.2μL
ddH2O14.6μL
(4)实时荧光定量PCR:
抽提PCR为阳性克隆的重组质粒DNA,测定其浓度(ng/μL),根据各质粒的分子量与质量浓度,计算成拷贝数,制得标准品。
将标准品按10倍梯度稀释成105-109,用作模板在实时定量PCR仪上进行扩增,建立反映Ct值与质粒拷贝数浓度对应关系的定量标准曲线。
按照试剂盒说明书建立反应体系和反应条件,自动采集荧光。
反应体系(20μL):
SYBRPremixExTaqⅡ(2×
)10μL
PCRForwardPrimer(mlas)0.8μL
PCRReversePrimer(mcrA-rev)0.8μL
DNA模板2μL
ddH2O6.4μL
反应条件:
按仪器操作说明选择熔解曲线分析:
C15s,60°
C15s,95°
C15s。
参考文献
[1]Steinberg,L.M.,andJ.M.Regan.2008.Phylogeneticcomparisonofthemethanogeniccommunitiesfromanacidic,oligotrohicfenandananaerobicdigestertreatingmunicipalwastewatersludge.Appl.Environ.Microbiol.74:
6663–6671.
[2]Steinberg,L.M.,andJ.M.Regan.2009.mcrA-Targetedreal-timequantitativePCRmethodtoexaminemethanogencommunities.Appl.Environ.Microbiol.75(13):
4435-4442.
[3]Cai,H.,andN.Jiao.2008.DiversityandabundanceofnitrateassimilationgenesinthenorthernSouth
ChinaSea.
MicrobEcol.56:
751-764.
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