流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术样本Word格式.docx
- 文档编号:13820589
- 上传时间:2022-10-13
- 格式:DOCX
- 页数:19
- 大小:240.81KB
流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术样本Word格式.docx
《流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术样本Word格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《流感病毒RNA荧光RTPCR检测技术样本Word格式.docx(19页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
一方面由逆转录酶将病毒RNA逆转录合成cDNA,然后再进行聚合酶链反映经25~30个循环,使DNA产物达到倍增效果。
二、试剂器材设备和器械
咽拭子液配制:
一瓶MEM液500ml,+8万单位庆大1.25ml,分装在5ml小管中,每管4ml。
小管最佳高压。
1、RNA提取试剂盒荧光PCR检测试剂盒
提取试剂盒组分:
洗脱液(ElutionBuffer)、载体核酸(CarrierRNA)、裂解结合增强液(Lysis/BindingEnhance)、裂解/结合液(Lysis/BindingSoln)、磁珠(RNABindingBeads)、洗涤液1(WashSoln1)、洗涤液2(WashSoln2)
荧光PCR检测试剂盒组分:
2×
RT-PCR反映液(2×
RT-PCRBuffer)、25×
RT-PCR酶混合液(25×
RT-PCREnzymeMix)、高G/C含量引物/探针检测增强剂
(DetectionEnhancer)、无核酸降解酶水(Nuclease-freeWater)
无水乙醇无水异丙醇
2、生物安全柜移液器微型离心机微型漩涡式混合器微型离心管PCR管冷冻盒带滤头吸头低温冰箱U型样品解决板96孔磁力板
三、操作环节
一.样本解决(在样本解决区进行)
依照咽拭子标本数,计算好所需配制裂解液和磁珠混合液量,即待测样本数+阴性对照+甲型对照+乙型对照+一种样本量为损耗。
需要配制液体仅仅是洗液:
洗液1:
向WashSolnConc.1瓶中加入12毫升无水异丙醇(100%)。
摇匀后室温保存;
洗液2:
向WashSolnConc.2瓶中加入32毫升无水乙醇(100%)。
摇匀后室温保存。
将含拭子转运液震荡2分钟,取50微升上清液进行核酸抽提。
剩余溶液-80℃保存。
1.配制裂解/结合液
每反映1ulCarrierRNA,每反映65ulLysis/BingingConc.,每反映65ul无水异丙醇。
摇匀后室温保存备用。
2.配制磁珠混合液
每反映10ulLysis/BingingEnhance,每反映10ulRNAbindingBeads。
混匀后4℃保存备用。
3.裂解/结合
U型板中顺次加入20ul磁珠混合液、50ul预解决后样品、130ul裂解/结合液。
漩涡振荡器上轻微振荡5分钟,完毕溶液混匀和核酸结合。
将U型板移至96孔磁力板上,静置3分钟。
将U型板保持在磁力板上,移去上清液。
4.洗涤液1洗涤2次:
将U型板从磁力板上拿下,加入150微升洗涤液1,漩涡振荡30秒
将U型板移至96孔磁力板上,静置2分钟。
将U型板保持在磁力板上,移去上清液
用150微升洗涤液1再洗涤一次。
尽量吸干上清液。
5.洗涤液2洗涤2次
将U型板从磁力板上拿下,加入150微升洗涤液2,漩涡振荡30秒
将U型板移至96孔磁力板上,静置1分钟。
用150微升洗涤液2再洗涤一次。
尽量吸干上清液
6.洗脱
将U型板从磁力板上拿下,漩涡振荡2分钟让剩余溶液挥发。
加入50微升ElutionBuffer,漩涡振荡3分钟。
将U型板移至96孔磁力板上,静置4分钟。
纯化核酸在上清液中,可直接用于PCR或转入干净离心管中-20℃储存。
二.扩增试剂准备与配备(在反映混合物配制区进行)
1、引物简介(不全,待续):
引物名称
碱基构成
检测基因
检测目
FluA-Forward
5’—GACCRATCCTGTCACCTCTGAC—3’
AM
甲型流感病毒通用引物,涉及季节流感和禽流感也可环境标本检测
FluA-Reverse
5’—GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG—3’
FluA-probe1
5’—TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG—3’
FluBForward
5’-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3’
BNS
乙型流感病毒通用引物
FluBReverse
5’-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3’
FluBprobe1
5’-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-3’
AH1Forward
5’-AACTACTACTGGACTCTRCTKGAA-3’
H1HA
季节性流感病毒H1亚型鉴定引物
AH1Reverse
5’-CCATTGGTGCATTTGAGKTGATG-3’
AH1Probe2
5’-TGAYCCAAAGCC”T”CTACTCAGTGCGAAAGC3-’
AH3Forward
5’-AAGCATTCCYAATGACAAACC-3’
H3HA
季节性流感病毒H3亚型鉴定引物
AH3Reverse
5’-ATTGCRCCRAATATGCCTCTAGT-3’
AH3Probe1
5’-CAGGATCACATATGGGSCCTGTCCCAG-3’
AH5aForward
5’—TGGAAAGTRTAARAAACGGAACGT—3’
H5HA
禽流感病毒H5亚型鉴定引物
AH5aReverse
5’—YGCTAGGGARCTCGCCACTG—3’
H5HA-probe
1
5’—TACCCGCAGTATTCAGAAGAAGC—3’
SwinfaForward
5’-GCACGGTCAGCACTTATYCTRAG-3’
SWH1NP
所有猪流感A病毒鉴定引物
Swinfareverse
5’-GTGRGCTGGGTTTTCATTTGGTC-3’
Swinfaprobe2
5’-CYACTGCAAGCCCA”T”ACACACAAGCAGGCA-3’
SWH1forward
5’-GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA-3’
SWH1HA
猪H1流感病毒
SWH1reverse
5’-CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC-3’
SWH1probe2
5’-CAGAATATACA“T”CCRGTCACAATTGGARAA-5’
RNP-Forward
5’—AGATTTGGACCTGCGAGCG—3’
RNP
内参基因,用于检测人源标本,且基因检测成果必为阳性,否则阐明采样不合格或核酸提取失败。
用于季节性流感、人禽流感病例检测
RNP-Reverse
5’—GAGCGGCTGTCTCCACAAGT—3’
RNP-probe1
5’—TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG—3
2、甲型H1N1流感病毒及其他流感病毒Real-timePCR引物和探针稀释办法:
1.引物工作浓度(40μM)
配制办法:
(1)将新合成引物开盖前短暂离心(1rpm,15s)。
(2)用RNaseFreeWater溶解,加水量为10×
总摩尔数,充分混匀,此时引物浓度为100μM,可作为储存液。
(例如:
假设合成引物每管2OD,若1OD量为4.75nmol(0.00475μmol),则一管引物总摩尔数为2×
4.75=9.5nmol,加水量为10×
9.5=95μl)
(3)将100μM引物2.5倍稀释,此时浓度为40μM,可作为工作浓度。
2.探针工作浓度(20μM)
(1)将新合成探针管开盖前短暂离心(1rpm,15s)。
(3)将100μM探针5倍稀释,此时浓度为20μM,可作为工作浓度。
以上配制仅仅是咱们工作中惯用配制详细配制核心是:
注意各引物管实际所标记OD数,以及各型引物探针规定工作浓度。
此为下发引物探针:
引物/探针名称
每管OD数
每管总摩尔数(nmol)
稀释成100μM储存液加RNasefreeWater体积(μl)
InfAForward
2
9.1
91
InfAReverse
8.3
83
InfAProbe
SWInfAForward
8.7
87
SWInfAReverse
SWInfAProbe
67
SWH1Forward
SWH1Reverse
SWH1Probe
6.7
RnaseP-Forward
10.5
105
RnaseP-Reverse
10
100
RnaseP-Probe
FluA-M-F30
10.8
108
FluA-M-R264
H1F1147
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 流感病毒 RNA 荧光 RTPCR 检测 技术 样本