对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法中国保健协会Word文档格式.docx

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1.2.2血清甘油三酯（TG）

1.2.3血清极低密度脂蛋白（VLDL）

1.2.4肝组织病理学检查

1.3方案三（亚急性酒精性肝损伤模型）

1.3.1体重

1.3.2血清中胆固醇（CHOL）

1.3.3血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL）

1.3.4血清中胆红素（TBIL）

1.3.5肝组织病理学检查

2试验原则

2.1所列指标均为必做项目。

2.2根据受试样品作用原理的不同，方案一、方案二和方案三任选其一进行动物实验。

3结果判定

方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）在模型成立的前提下，ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性，可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。

方案二（急性酒精性肝损伤模型）：

血清中TG、VLDL指标阳性和病理组织学检查结果阳性，可判定该受试样品具有对急性酒精性肝损伤有辅助保护功能功能。

方案三（亚急性酒精性肝损伤模型）：

血清中CHOL、LDL和TBIL三项检测指标结果阳性，可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能作用；

血清中CHOL、LDL和TBIL三项指标中任两项结果阳性，且肝脏病理组织学检查结果阳性，可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能功能。

在急性或亚急性酒精性肝损伤结果判定中，任何一项方案为阳性时，可认为该受试物具有降低酒精性肝损伤危害功能。

对化学性肝损伤有辅助保护功能检验方法

MethodfortheAssessmentofAssistingtheProtectionAgainstChemicalInjuryofLiverFunction

1方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）

1.1原理

刀豆蛋白A（concanavalinA,ConA）是一种在人体内对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素，它能在体外激活T细胞的丝裂原，进入循环后首先活化T淋巴细胞，继而激活肿瘤坏死因子（TNF）和白介素2等细胞因子，引发炎症反应，可诱导淋巴细胞、巨噬细胞的细胞毒作用，通过肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞。

1.2实验动物

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠（180-220克），每组8-12只；

小鼠（18－22克），每组10-15只。

1.3实验方法

1.3.1剂量和分组

至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。

以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）一个剂量（等效应剂量），另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量（以公斤计算）的30倍。

1.3.2受试样品的给予

经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。

原则上连续给予30天，必要时可延长至45天。

1.3.3实验步骤

1.3.3.1造模方法

每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水。

将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。

模型组及各样品组于实验结束时一次尾静脉给予剂量为15～20mg/kg的刀豆蛋白A，小鼠10ml/kgBW，禁食8h后经腹腔注射60mg/kgBW的戊巴比妥钠溶液麻醉，腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。

1.3.3.2检测指标

体重、血清中谷丙转氨酶（ALT）、血清中谷草转氨酶（AST）、血清中乳酸脱氢酶（LDH）、肝脏病理组织学变化。

1.4血清ALT、AST和LDH的测定

1.4.1检测方法

血清中ALT、AST推荐采用速率法，

LDH推荐采用乳酸为底物的速率法（LD-L法）。

血样离心（2500rpm）后取上清，血清中的ALT、AST和LDH的检测采用用全自动或半自动生化分析仪进行。

1.4.2数据处理

数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。

方差齐，计算F值，F值＜F0.05，各组均数间差异无显著性；

F值＞F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。

对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；

若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

1.4.3结果判定

模型对照组与阴性对照组比较，血清ALT、AST和LDH含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。

在模型成立的前提下，受试样品组血清ALT、AST和LDH含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），可分别判定ALT、AST和LDH指标结果阳性。

1.5肝脏病理组织学检查

1.5.1实验材料

取小鼠肝脏左叶用10%福尔马林固定，从肝左叶中部做横切面取材，常规病理制片（石蜡包埋，HE染色）。

1.5.2镜检

从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用5倍物镜连续观察整张组织切片，可见肝脏多发的灶状、片状坏死。

1.5.3评分标准

肝细胞坏死：

大致正常

偶见坏死细胞

坏死细胞小于整个视野的1/4

坏死细胞占整个视野的1/4～1/2

坏死细胞占整个视野的1/2～3/4

0分

1分

2分

3分

4分

坏死细胞弥漫整个视野

5分

1.5.4数据处理

采用方差分析或秩和检验。

但方差分析需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，各组均数间差异无显著性；

1.5.5病理结果判定

模型对照组与阴性对照组比较肝细胞坏死程度加重有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。

在模型成立的前提下，受试样品任何一个剂量组与模型对照组比较，肝细胞坏死程度减轻，有统计学意义（P＜0.05），可判断为阳性结果。

1.6结果判断

在模型成立的前提下，ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性，可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。

2.方案二：

急性酒精性肝损伤模型

2.1原理

机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧酸循环和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢。

乙醇通过增加甘油三酯合成，减少脂肪氧化，降低肝脏运出脂肪的功能，增加脂肪组织的脂肪动员,引起早期酒精性脂肪肝和高脂血症。

2.2实验动物

2.3实验方法

2.3.1剂量和分组

以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量（以公斤计算）的30倍。

用无水乙醇（分析纯）造成肝损伤模型，无水乙醇浓度为50％（以纯净水稀释），灌胃量12ml～14ml/kgBW（乙醇密度0.8g/ml，折合乙醇的剂量为4800～5600mg/kgBW）。

2.3.2给予受试样品的途径和时间

原则上连续给予30天.

2.3.3实验步骤和造模方法

将动物每周称重两次，按体重调整受试样品量。

模型对照组和各样品组于实验结束时一次灌胃给予50%的乙醇，小鼠灌胃量12ml/kgBW，阴性对照组给予纯净水，禁食16h。

动物腹腔注射60mg/kgBW的戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。

2.3.4检测指标

体重、血清中甘油三酯（TG）、血清中极低密度脂蛋白（VLDL）、肝组织病理学检查（肝细胞脂肪变性）。

2.4血清中甘油三酯（TG）测定

2.4.1测定方法

推荐采用酶法（GPO-PAP法）。

采用用全自动或半自动生化仪测定血清中TG的含量。

2.4.2数据处理

数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：

各组均数间差异无显著性；

F值＞F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；

2.4.3结果判定

模型对照组与阴性对照组比较TG含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。

在模型成立的前提下，受试样品组TG含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），判定该指标结果阳性。

2.5血清中极低密度脂蛋白（VLDL）测定

2.5.1测定方法

推荐采用ELISA法。

采用极低密度脂蛋白ELISA试剂盒测定血清中的VLDL的含量。

2.5.2数据处理

2.5.3数据处理

2.5.4结果判定

模型对照组与阴性对照组比较，血清VLDL含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。

在模型成立的前提下，受试样品组血清VLDL含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），判定该指标结果阳性。

2.6肝脏病理组织学变化、诊断标准和结果判定

2.6.1实验材料

从小鼠肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，苏丹Ⅲ染色。

2.6.2镜检

从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用5倍物镜连续观察整张组织切片。

主要观察脂滴在肝脏的分布范围和面积。

2.6.3评分标准

肝细胞内脂滴无或稀少。

含脂滴的肝细胞不超过1/4

含脂滴的肝细胞不超过1/2

含脂滴的肝细胞不超过3/4

肝组织几乎被脂滴代替

2.6.4数据处理

方差分析需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：

2.6.5结果判定

模型对照组与阴性对照组比较脂肪变性程度加重有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。

在模型成立的前提下，受试样品任何一个剂量组与模型对照组比较，脂肪变性程度减轻，有统计学意义（P＜0.05），可判断为阳性结果。

2.7急性酒精性肝损伤的结果判断

在模型成立的