Slug-siRNA转染对胰腺癌细胞生长的影响文档格式.docx
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增殖;
凋亡;
胰腺肿瘤;
CaPan-2
Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因,是PUMA基因的强烈抑制剂【1-2】。
本文旨在研究Slug基因沉默后对胰腺癌细胞的增殖和凋亡的影响,探讨胰腺癌基因治疗的新靶点。
材料和方法
1材料和试剂:
人胰腺癌细胞株PaCan-2购自 上海细胞所、pGenesil-1质粒购自Austin,USA、感受态大肠杆菌DH5α购自武汉晶赛生物工程技术公司、限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4连接酶为Promega公司产品、LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品、四甲基偶氮唑蓝(MTT)为sigma公司产品、BCA蛋白浓度测定试剂盒及敏感曝光试剂盒为Pierce公司产品;
Slug多克隆抗体及G3PDH抗体为SantaCruz公司产品、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗为北京中山公司产品。
凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自宁波中鼎公司;
siRNA的转录模板由上海生工合成,合成的序列分别为Slug-siRNA(GenBankaccessionno.AK223368,目的片段作用于Slug编码区的523-541位,下划线表示19bp)
sense:
5-GATCCGACTACAGTCCAAGCTTTCTTCAAGACGTTGATGTCAGGTTCGAAAGTTTTTGAATTCA-3antisense:
3-CTAGGCTGATGTCCAGGTTCGAAAGAAGTTCTGCAACTACAGTCCAAGCTTTCAAAAACTTAAGT-5;
Negative-siRNA:
(与人类编码基因序列无同源性的碱基序列,使用BLAST方法排除):
5-GATCCCAGACTTGAAACCCGTTTcTTCAAGACGcTAGTgTCGGATTAAACGGTTTTTGAATTCA-3;
antisense:
3-GATAGGTTGGACTTGTTTCTAAGTTCTGCACATCCCATGGGCAATTTGAAAAACAGCTGTGCGA-5;
2质粒的构建:
合成的siRNA转录模板长度为64bp,在序列中间为加入9个茎环序列分隔的正反向靶序列,尾端插入5个TTTTT作为终止序列,上游和下游分别加了BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,pGenesil-1质粒经BamHⅠ、HindⅢ酶切后与合成的表达模板DNA片段用T4DNA连接酶连接(16O°
C,8h),转化DH5α菌株,涂卡那霉素琼脂平板,挑选阳性克隆,扩增并提取质粒,用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,酶切鉴定正确的克隆送上海英骏生物公司测序,测序正确后大量提取质粒.
方法
1细胞培养:
胰腺癌细胞CaPan-2购自中科院上海细胞所,细胞用含10%胎牛血清的RPMR1640培养基培养,细胞培养条件为37°
C恒温,饱和湿度和5%CO2,每2-3天传代一次,指数生长的细胞为实验对象。
2细胞瞬时转染:
在6孔培养板中常规接种CaPan-2细胞,待细胞70-80%融合后,经LipofectamineTM2000介导质粒转染CaPan-2细胞72h(按试剂盒说明操作)。
3AnnexinV-FITC/PI染色:
收集三组细胞,每组设三个复孔。
用去离子水按1:
4稀释结合缓冲液。
用4℃预冷的1×
PBS洗细胞2次,用250µ
l结合缓冲液重悬细胞,调节其浓度为1×
106/ml。
取100µ
l的细胞悬液于5ml流式管中,加入5µ
lAnnexinⅤ/FITC和10µ
l20µ
g/ml的PI溶液。
混匀后于室温避光孵育15min。
在反应管中加入400µ
lPBS,混匀,流式细胞仪(FACS)分析,激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI。
4MTT测定:
取对数生长期的三组细胞用0.25%Trypsin-EDTA消化成单细胞悬液接种于96孔培养板,104细胞/孔,每孔加入200µ
l含10%FBS的高糖DMEM液,分别培养0,12,24,36,48,72h,每组设3个复孔。
在每个时间点加入5mg/ml的MTT液(20µ
l/孔),继续培养4h,培养条件同上。
吸出孔内培养液后,加入DMSO液(150µ
l/孔),将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10min,使结晶物充分溶解,酶标仪检测各孔A570值,绘制连续5d的细胞生长曲线。
实验重复3次,结果用x±
s表示。
5Hoechst33258和PI染色:
Hoechst33342可以穿透细胞膜,染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。
PI不能穿透细胞膜,对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。
而对于坏死细胞,其细胞膜的完整性丧失,PI可以染色坏死细胞。
上述两种染料双染后,使用荧光显微镜观察,正常细胞为弱红色荧光+弱蓝色荧光,凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光,坏死细胞为强红色荧光+强蓝色荧光。
三组细胞接种于6孔板中,72h取出玻片,用1×
PBS洗一次。
加入细胞染色缓冲液。
加入5µ
lHoechst染色液。
lPI染色液。
混匀,4℃孵育30min。
PBS洗涤一次。
避光干燥后在荧光显微镜下检测红色和蓝色荧光。
6免疫组化检测:
将盖玻片加入6孔板中,3组细胞分别铺板到6孔板中培养72h。
1×
PBS洗涤1次,10%中性福尔马林4℃固定过夜。
次日,吸去固定液,取出玻片,晾干备用。
30%H2O21份+甲醇50份混合,室温浸泡30min,以灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗3次。
后续步骤参考说明书。
7WesternBlot检测蛋白的表达:
按说明书方法进行操作,提取细胞总蛋白进行WesternBlot检测:
SDS-PAGE分离胶浓度为12%,积层胶浓度为5%,上样量为15μg.L-1;
SDS电泳:
恒流,每块板20~40mA,电泳时间约2h;
转膜:
恒流,每张膜42mA,时间:
3.5h。
8RT-PCR:
按TRizol试剂盒(Invitrogen公司)说明书操作提取不同组细胞总RNA,取1μgRNA模按RT试剂盒(Takara公司)说明书反转录得到cDNA。
引物序列:
Slug(414bp):
R:
5'
-CGTCACGACGGGTCAGAT-3'
F:
5’-ATCTGACCCGTCGTGACG-3’
反应条件:
50℃30分钟,94℃2分钟,94℃30秒,55℃30秒,72℃1分钟,72℃延伸7分钟,28循环。
以上引物由赛百盛公司合成。
取5μL反应产物在含EB的1.5%琼脂糖凝胶上电泳,用SYNGENE型凝胶成像系统照像,以目的基因条带和内参G3PDH条带扫描峰下面积之比作为目的基因的相对表达量。
试验重复3次,数据以x±
结果
1Slug-siRNA抑制Slug基因和蛋白表达:
Slug检测发现,CaPan-2/pSlug-siRNA细胞内Slug蛋白和Slug-mRNA表达已被显著抑制,而CaPan-2/pNeg-siRNA细胞内Slug蛋白和Slug-mRNA表达无明显变化,提示Slug-siRNA抑制了细胞内Slug的表达。
2MTT检测:
PaCan-2/pSlug-siRNA和PaCan-2/pNeg-siRNA两组细胞生长能力差异无统计学意义(P>
0.05)。
而实验组细胞的生长能力较低,细胞增殖明显滞后于前两组细胞,差异有统计学意义(P<
3AnnexinV-FITC/PI检测
FCM显示转染72h后,PaCan-2/pSlug-siRNA和PaCan-2/pNeg-siRNA细胞的凋亡率均较低,差异无统计学意义(P>
Slug-siRNA组细胞的凋亡率明显增高,与其他两组组比较,差异有统计学意义(P<
5Hoechst33258和PI双染色检测细胞凋亡:
荧光显微镜下,对照组和CaPan-2/pNeg-siRNA组细胞主要表现为弱红色荧光+弱蓝色荧光,两种荧光在强度和比例上无明显差别。
CaPan-2/pSlug-siRNA组细胞主要为蓝色容光,说明细胞的凋亡现象明显。
讨论
PUMA是2001年发现的bcl-2家族BH-3亚家族中的成员,是p53介导的下游促凋亡基因,PUMA活化后,导致下游的bax活化,细胞色素C释放和caspase反应,最终导致细胞凋亡[3-5]。
Slug是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因,最初发现它与细胞的生存活力有关[6],后来发现与促癌转移有关[7-8]。
最近研究发现[1-2,9-10],Slug是PUMA的强烈抑制剂,Slug通过抑制PUMA表达而对细胞凋亡起阻碍作用,而抑制Slug表达后可解除Slug对PUMA表达的抑制,发挥了PUMA的促凋亡作应。
本研究利用RNA干扰技术探讨了Slug沉默后对胰腺癌CaPan-2细胞凋亡和增殖的影响。
实验发现Slug-siRNA转染沉默Slug后,细胞内Slug的蛋白和基因表达几乎完全被抑制,同时伴随着细胞增殖能力下降,细胞凋亡率的明显提高,说明Slug沉默有效地抑制体外胰腺癌细胞生长。
转染了阴性对照质粒的细胞与正常细胞相比Slug蛋白的抑制及体内外增殖和凋亡方面均无明显差异,说明该质粒可以安全有效地应用。
本研究初步证明了利用RNA干扰技术针对Slug靶点能抑制胰腺癌细胞的体外生长,为胰腺癌的基因治疗提供了一个新的切入点。
参考文献
[1]WuWS,HeinrichsS,XuD.Slugantagonizesp53-mediatedapoptosisofhematopoieticprogenitorsbyrepressingpuma.Cell.2005;
123(4):
641-53
[2]VanniniI,BonafeM,TeseiAShortinterferingRNAdirectedagainsttheSLUGgeneincreasescelldeathinductioninhumanmelanomacelllinesexposedtocisplatinandfotemustine.CellOncol.2007;
29(4):
279-87
[3]YuJ,ZhangL,HwangPM,etal.PUMAinducestherapidapoptosisofcolorectalcancercell[J].MolecularCell,2001,7:
673-682
[4]Nakano,K.H.Vousden.PUMA,anovelproapoptoticgene,isinducedbyp53[J].Mol.Cell,2001,12(7):
683–6
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- Slug siRNA 转染 胰腺癌 细胞 生长 影响