实时荧光定量PCR具体实验步骤文档格式.docx

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①浓度测定

A260下读值为1表示40μgRNA/ml。

样品RNA浓度（μg/ml）计算公式为：

A260×

稀释倍数×

40μg/ml。

具体计算如下：

RNA溶于40μlDEPC水中.取5ul.1:

100稀释至495μl的TE中.测得A260=0.21RNA浓度=0.21×

100×

40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后.剩余样品RNA为35μl.剩余RNA总量为：

35μl×

0.84μg/μl=29.4μg

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度.比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定

1制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中.冷却至60℃.10ml的10×

MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3M）。

10×

MOPS电泳缓冲液

浓度成分

0.4MMOPS.pH7.0

0.1M乙酸钠

0.01MEDTA

灌制凝胶板.预留加样孔至少可以加入25μl溶液。

胶凝后取下梳子.将凝胶板放入电泳槽内.加足量的1×

MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

2准备RNA样品

取3μgRNA.加3倍体积的甲醛上样染液.加EB于甲醛上样染液中至终浓度为

10μg/ml。

加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳上样前凝胶须预电泳5min.随后将样品加入上样孔。

5–6V/cm电压下2h.电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。

4紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型）.上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。

还有可能观察到一个更小稍微扩散的带.它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。

在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质.可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

RNA制备过程中如果出现DNA污染.将会在28S核糖体RNA带的上面出现.即更高分子量的弥散迁移物质或者带.RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

用数码照相机拍下电泳结果。

3样品cDNA合成

1反应体系

序号反应物剂量

1

逆转录buffer2μl

2

上游引物

0.2μl

3

下游引物

4

dNTP

0.1μl

5

逆转录酶

MMLV0.5μ

6

DEPC水

5μl

7

RNA模版

2μl

8

总体积

10μl

轻弹管底将溶液混合.6000rpm短暂离心。

2混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟.取出后立即冰水浴至管内外温度一致.然后加逆转录酶0.5μl.37℃水浴60分钟。

3取出后立即95℃干浴3分钟.得到逆转录终溶液即为cDNA溶液.保存于-80℃待用。

4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR

1β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011.反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010.依次稀释至109、108、107、106、105、104.以备用。

2反应体系如下：

标准品反应体系

序号

反应物剂量

SYBRGreen1染料

10μ

阳性模板上游引物F

0.5μ

阳性模板下游引物R

dNTP0.5μl

Taq酶1μl

阳性模板DNA5μl

ddH2O32.5μl

总体积50μl

管家基因反应体系：

1SYBRGreen1染料10μl

2内参照上游引物F0.5μl

3内参照下游引物R0.5μl

4dNTP0.5μl

5Taq酶1μl

6待测样品cDNA5μl

7ddH2O32.5μl

8总体积50μl

3制备好的阳性标准品和检测样本同时上机.反应条件为：

93℃2分钟.然后93℃1分钟.55℃2分钟.共40个循环。

5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

①针对每一需要测量的基因.选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

反应体系：

110×

PCR缓冲液2.5ul

2MgCl2溶液1.5ul

3上游引物F0.5ul

4下游引物R0.5ul

5dNTP混合液3ul

6Taq聚合酶1ul

7cDNA1ul

8加水至总体积为25ul

35个PCR循环（94℃1分钟；

55℃1分钟；

72℃1分钟）；

72oC延伸5分钟。

②PCR产物与DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳.溴化乙锭染色.检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

3将PCR产物进行10倍梯度稀释:

将PCR产物进行10倍梯度稀释:

设定PCR产物浓度为1×

1010.依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6待测样品的待测基因实时定量PCR

①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。

体系配置如下：

1SYBRGreen1染料10ul

2上游引物1ul

3下游引物1ul

4dNTP1ul

5Taq聚合酶2ul

6待测样品cDNA5ul

7ddH2O30ul

8总体积50ul

②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。

反应条件为：

93℃2分钟预变性.然后按93℃1分钟.55℃1分钟.72℃1分钟.共40做个循环.最后72℃7分钟延伸。

7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件：

PrimerPremier5.0.并遵循以下原则：

引物与模板的序列紧密互补；

引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；

引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

8电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。

PCR产物与DNA

Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳.GoldView?

染色.检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

实时荧光定量PCR组织RNA提取：

一般认为100mg肝组织提取RNA500ng.100m肺g提取RNA200ng.脑内的RNA丰度适中.100mg脑组织.提取RNA5-200ng。

所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。

反转录反应

反转录反应参照TaKaRaRT-PC说R明书。

反转录反应条件如下。

37°

C15min（反转录反应）

85°

C5sec（反转录酶的失活反应）RealTimePCR反应

选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因.核糖体18SrRNA（18SrRNA）做为内参。

基因

引物序列

扩增片段长度

NR2B

NR2B（+）

CCGCAGCACTATTGAGAACA

213bp

NR2B（–）

ATCCATGTGTAGCCGTAGCC

18srRNA

18srRNA（+）

TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA

198bp

18srRNA（–）

CGTTTATGGTCGGAACTACGA

1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）

试剂

使用量

终浓度

?

TM

12.5μl

1×

SYBRPremixExTaq（2×

）

PCRForwardPrimer（10μM）

1μl

0.4μM

PCRReversePrimer（10μM）

模板（cDNA溶液）

0.5μl

dH2O

10μl

Total

25μl

全班40人.分为5组.每组做8管。

4管做BDNF.4管做18SrRNA。

4管BDNF或者18SrRNA.采用相应的正反PCR引物。

每种基因做两个模板.一个模板采用原液浓度.一个模板采用稀释一倍浓度.体积均为0.5μl。

2）三步法PCR

首先95°

C作用3min

PCR进行35个循环。

步骤

温度

时间

变性

95°

C

30秒

退火

58°

延伸

72°

融解曲线

变温速度

0秒

20°

C/秒

55°

15秒

0.1°

PCR疑难解答

当PCR结果不甚满意时.首先检查以下几方面并遵照执行：

1将PCR反应的试管与反应板紧贴。

2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时.切记在加入酶后稍3微振荡一下.因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。

4不要随意减少dNTP的用量.它是一个系统的因素.必须与其它成份保持平衡。

5对于有问题的PCR反应.例如模板的量少.模板不纯和环状模板等.先尝试加Taq酶前的体系进行预变性.后加模板进行正常PC