实时荧光定量PCR具体实验步骤文档格式.docx
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①浓度测定
A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:
A260×
稀释倍数×
40μg/ml。
具体计算如下:
RNA溶于40μlDEPC水中.取5ul.1:
100稀释至495μl的TE中.测得A260=0.21RNA浓度=0.21×
100×
40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后.剩余样品RNA为35μl.剩余RNA总量为:
35μl×
0.84μg/μl=29.4μg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度.比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
1制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中.冷却至60℃.10ml的10×
MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。
10×
MOPS电泳缓冲液
浓度成分
0.4MMOPS.pH7.0
0.1M乙酸钠
0.01MEDTA
灌制凝胶板.预留加样孔至少可以加入25μl溶液。
胶凝后取下梳子.将凝胶板放入电泳槽内.加足量的1×
MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
2准备RNA样品
取3μgRNA.加3倍体积的甲醛上样染液.加EB于甲醛上样染液中至终浓度为
10μg/ml。
加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳上样前凝胶须预电泳5min.随后将样品加入上样孔。
5–6V/cm电压下2h.电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
4紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型).上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带.它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质.可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染.将会在28S核糖体RNA带的上面出现.即更高分子量的弥散迁移物质或者带.RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
3样品cDNA合成
1反应体系
序号反应物剂量
1
逆转录buffer2μl
2
上游引物
0.2μl
3
下游引物
4
dNTP
0.1μl
5
逆转录酶
MMLV0.5μ
6
DEPC水
5μl
7
RNA模版
2μl
8
总体积
10μl
轻弹管底将溶液混合.6000rpm短暂离心。
2混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟.取出后立即冰水浴至管内外温度一致.然后加逆转录酶0.5μl.37℃水浴60分钟。
3取出后立即95℃干浴3分钟.得到逆转录终溶液即为cDNA溶液.保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
1β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011.反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010.依次稀释至109、108、107、106、105、104.以备用。
2反应体系如下:
标准品反应体系
序号
反应物剂量
SYBRGreen1染料
10μ
阳性模板上游引物F
0.5μ
阳性模板下游引物R
dNTP0.5μl
Taq酶1μl
阳性模板DNA5μl
ddH2O32.5μl
总体积50μl
管家基因反应体系:
1SYBRGreen1染料10μl
2内参照上游引物F0.5μl
3内参照下游引物R0.5μl
4dNTP0.5μl
5Taq酶1μl
6待测样品cDNA5μl
7ddH2O32.5μl
8总体积50μl
3制备好的阳性标准品和检测样本同时上机.反应条件为:
93℃2分钟.然后93℃1分钟.55℃2分钟.共40个循环。
5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因.选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系:
110×
PCR缓冲液2.5ul
2MgCl2溶液1.5ul
3上游引物F0.5ul
4下游引物R0.5ul
5dNTP混合液3ul
6Taq聚合酶1ul
7cDNA1ul
8加水至总体积为25ul
35个PCR循环(94℃1分钟;
55℃1分钟;
72℃1分钟);
72oC延伸5分钟。
②PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳.溴化乙锭染色.检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
3将PCR产物进行10倍梯度稀释:
将PCR产物进行10倍梯度稀释:
设定PCR产物浓度为1×
1010.依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
体系配置如下:
1SYBRGreen1染料10ul
2上游引物1ul
3下游引物1ul
4dNTP1ul
5Taq聚合酶2ul
6待测样品cDNA5ul
7ddH2O30ul
8总体积50ul
②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。
反应条件为:
93℃2分钟预变性.然后按93℃1分钟.55℃1分钟.72℃1分钟.共40做个循环.最后72℃7分钟延伸。
7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件:
PrimerPremier5.0.并遵循以下原则:
引物与模板的序列紧密互补;
引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;
引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
8电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。
PCR产物与DNA
Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳.GoldView?
染色.检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
实时荧光定量PCR组织RNA提取:
一般认为100mg肝组织提取RNA500ng.100m肺g提取RNA200ng.脑内的RNA丰度适中.100mg脑组织.提取RNA5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRaRT-PC说R明书。
反转录反应条件如下。
37°
C15min(反转录反应)
85°
C5sec(反转录酶的失活反应)RealTimePCR反应
选用脑源神经营养因子(BDNF)为目标基因.核糖体18SrRNA(18SrRNA)做为内参。
基因
引物序列
扩增片段长度
NR2B
NR2B(+)
CCGCAGCACTATTGAGAACA
213bp
NR2B(–)
ATCCATGTGTAGCCGTAGCC
18srRNA
18srRNA(+)
TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA
198bp
18srRNA(–)
CGTTTATGGTCGGAACTACGA
1)按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)
试剂
使用量
终浓度
?
TM
12.5μl
1×
SYBRPremixExTaq(2×
)
PCRForwardPrimer(10μM)
1μl
0.4μM
PCRReversePrimer(10μM)
模板(cDNA溶液)
0.5μl
dH2O
10μl
Total
25μl
全班40人.分为5组.每组做8管。
4管做BDNF.4管做18SrRNA。
4管BDNF或者18SrRNA.采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板.一个模板采用原液浓度.一个模板采用稀释一倍浓度.体积均为0.5μl。
2)三步法PCR
首先95°
C作用3min
PCR进行35个循环。
步骤
温度
时间
变性
95°
C
30秒
退火
58°
延伸
72°
融解曲线
变温速度
0秒
20°
C/秒
55°
15秒
0.1°
PCR疑难解答
当PCR结果不甚满意时.首先检查以下几方面并遵照执行:
1将PCR反应的试管与反应板紧贴。
2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时.切记在加入酶后稍3微振荡一下.因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。
4不要随意减少dNTP的用量.它是一个系统的因素.必须与其它成份保持平衡。
5对于有问题的PCR反应.例如模板的量少.模板不纯和环状模板等.先尝试加Taq酶前的体系进行预变性.后加模板进行正常PC
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