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因此,市场上辅酶Q商品主要是辅酶Q10。
辅酶Q10是细胞能量物质三磷酸腺苷(ATP)生成过程中不可缺少的组成成分,参与线粒体呼吸链上氧化磷酸化反应中的电子和质子传递,是所有细胞发挥在正常功能不可或缺的基础。
辅酶Q10在临床上有着广泛的应用,有增强人体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、保护心脏和大脑、改善微循环、促进学习记忆、提高运动能力等作用。
目前辅酶Q10作为具有医学价值的重要生化药物、保健食品的良好材料或化妆品的原料,越来越受到人们的关注。
(1)辅酶Q10的生产方式
目前辅酶Q10的生产方式有三种:
动植物组织提取法、微生物发酵法和化学合成法。
目前国内主要采取动植物组织提取法,国外多采用微生物发酵法生产CoQ10。
动植物组织提取法是指指从动物的脏器或一些植物的组织中提取产品,但提取效率一般较低,并且受原料来源限制,因此产品成本高,价格昂贵,规模化生产受到制约。
化学合成法步骤繁杂,条件苛刻。
目前国内主要采用茄尼醇和进口的3,4,5-三甲氧基甲苯为原料合成CoQ10,但由于茄尼醇制得的烯丙基化试剂是顺、反异构体的混合物,活性不强需分离,且副产物含量多,提纯成本也高,因此这种方法的应用也受到了限制。
微生物发酵法生产CoQ10具有经济、不受原料的限制、易大规模生产、分离纯化、产品活性好等特点,因此颇受青睐,是一种最有前途的方法。
但由于提取受到菌种、发酵工艺及下游提取工艺的限制,其大规模生产仍有很多难题。
国外这方面的工作开展得比较早,尤其是日本,早在20世纪70年代中期,就已经完善了CoQ10的发酵法工业化生产技术,全球90%的CoQ10产量来自日本。
我国于90年代开始对微生物发酵法生产CoQ10进行研究和
开发,但由于受菌种、产量低、提取收率不高等因素的影响,还未见有大规模工业化生产的有关报道。
因此开展这方面的研究,尽早实现国产工业化生产显得尤为重要。
国外在辅酶Q的研究和市场上都要走在中国前面,中国辅酶Q产业要想发展起来并与国外竞争特别是与日本竞争,就要努力发展先进的辅酶Q生产工艺。
因此,我们要将辅酶Q进行大规模生产,而微生物发酵法就成为了我们唯一的选择。
对于国内企业,要想进入辅酶Q市场,不仅面对国外竞争者,也要面对国内竞争者。
目前国内的辅酶Q产品主要靠进口,国外竞争者在这个市场上已经很成熟了,并且形成了一定的规模。
要在国内市场上抢夺外国公司的份额,就要以不低于外国价格来提供足够的产品,这不仅仅是对产品品质的要求,还是对生产规模的要求。
当掌握了技术后,大规模生产就成为可能。
在这个你狭小的市场上,将来少数几家公司能在辅酶Q这个市场上赠到钱。
这就要求企业要么就不进入这个行业,要进入就要以最快的速度攻破技术难关,达到大规模化生产。
我们公司如今决定进入这个市场,并采用发酵法生产辅酶Q10是一个明智的选择,但也存在最大的技术难关等待我们来攻破。
这是一个艰巨且紧迫的任务,有一系列的问题等待我们来解决。
二、辅酶Q10的发酵工艺
2.1诱变育种
野生菌株很难突破(或解除)微生物细胞自我调控机制使辅酶Q10大量积累,因此可以通过化学或物理诱变,获得营养缺陷型突变株或抗结构类似物突变株,提高辅酶Q10产量。
使用诱变手段对野生型菌株进行基因突变,通过适当的筛选方法,得到产量显著提高或者发酵特性显著改善的突变株如营养缺陷型或抗结构类似物突变株等。
Rudney于1976年提出了CoQ10的微生物合成途径主要分为芳香环合成及聚异戊二烯基侧链的生物合成路线,大致合成途径如图1和图2所示。
这也是诱变育种的理论基础。
虽然在原核细胞和真核细胞中合成CoQ10的前体物质来源不同,但其合成途径主要由以下三个部分构成,即核心醌环的合成,聚异戊二烯侧链的合成及醌环的修饰。
通过研究CoQ10在菌体内的合成过程就可以为控制能量代谢流及菌种选育提供理论依据。
根据芳香环及异戊二烯基侧链的生物合成途径结合细菌的代谢调节机制,CoQ10工业发酵高产菌株的选育途径可分为:
(1)选育营养缺陷型突变株
由异戊烯基侧链及芳香环的生物合成途径路线,选育营养缺陷型突变株,有利于提高所需产物的浓度。
Olson和Rudney发现类胡萝卜素与CoQ10均以聚异戊二烯为前体物进行合成代谢,减少类胡萝卜素的生成量可能会促进CoQ10的生物合成。
因此,选育类胡萝卜素缺陷型(greenmutant)的PSB突变株可提高CoQ10的含量。
Yoshida等对R.sphaeroidesKY-4113进行诱变筛选,获得的一株绿色突变株,CoQ10含量比野生株提高178.7%。
依据代谢调控原理,减弱或切断CoQ10的分支途径如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等含有苯环的芳香族化合物且与CoQ10合成有共同前体的代谢合成途径即有可能提高CoQ10产量。
刘克杉以根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)为出发菌株,通过用亚硝基胍及硫酸二乙酯的双重诱变处理,筛选到酪氨酸、天冬氨酸双重缺陷型的突变株,其CoQ10产量较原始菌株提高了91.28%。
张延静以假白布勒弹孢酵母(Bullerapseudoalba)为材料,研究添加物对产量的影响。
发现豆油、豆粉、西红柿汁、桔子皮汁因富含CoQ10和胡萝卜素合成的前体物质而提高了CoQ10的产量;
烟叶和β-胡萝卜素则因阻断了合成β-胡萝卜素的途经而使合成CoQ10的代谢通量变大,使CoQ10产量得到了提高。
可见微生物中CoQ10的合成与胡萝卜素合成密切相关,因此可以通过筛选胡萝卜素的营养缺陷型菌株作为CoQ10的高产菌株。
Olson和Rundey[8]选育了光合细菌的类胡萝卜素营养缺陷型菌株来提高CoQ10的含量Yoshida[9]以类球红细菌KY-4113为出发菌株,初始的CoQ10含量为2.4mg/g干细胞,进行突变育种,筛选出类胡萝卜素缺陷型的高产
突变株CL-37、Co-22、Co-22-11分别较出发菌株提高了88%、150%、263%。
目前日本已经利用诱变菌株Co-22-11进行发酵生产,其产量可达到770mg/L发酵液。
(2)选育代谢拮抗物抗性突变株
解除抑制物对CoQ10合成或其相关合成代谢的抑制作用可增加CoQ10的含量。
抗CoQ10合成反馈抑制的结构类似物主要有:
L-乙硫氨酸(合成CoQ10的前体L-甲硫氨酸的结构类似物)、柔红霉素、维生素K3以及一些芳香族化合物(CoQ10的结构类似物或呼吸系统的抑制剂)等。
[5]通过筛选抗CoQ10合成的前体物,抑制物及其结构类似物的土壤杆Yoshida等
菌属突变株,获得的Agrobacteriumtumefaciens突变株AU-55,其产CoQ10的能力比野生株提高79%。
放线菌素D(ActinomycinD,ActD)是一种致畸剂和致癌剂,其结构中含有1个平面性的吩恶嗪环及2个环状五肽,可以插入到DNA分子中,并可选择性地抑制__转录和蛋白质合成。
因此ActD具有很强的细胞毒性,在培养基中加入一定量的ActD会对菌体细胞产生胁迫毒害作用。
CoQ10是一种能提高机体免疫力的生理活性物质,诱变后如果能得到抗ActD突变株,表明该突变株胞内的CoQ10等生理活性物质的积累量就有可能提高。
潘春梅[11]以放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)WSH2601为出发菌株,以放线菌素D抗性作为筛选高产CoQ10突变株的筛选模型,经紫外线和亚硝基胍复合诱变,得到了产CoQ10的高产菌株。
再通过摇瓶实验优化培养,最终CoQ10产量达34mg/L,是诱变和优化前产量的3.6倍。
2.2基因工程育种
利用分子生物学技术,将产CoQ10的关键酶基因通过基因载体引入到大肠杆菌中,使关键酶基因拷贝数增加并高效表达,从而增强CoQ10的合成能力,这就是基因工程构建发酵产CoQ10菌株的基本路线。
在微生物细胞中合成CoQ10的限速步骤为其核心结构苯醌环的前体对羟基苯甲酸(PHB)与侧链结构聚异戊二烯焦磷酸(PPP)的缩合反应,催化该反应的酶为对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶。
通过基因工程技术将编码该关键酶的基因(ddsA)导入生产菌株,是构建辅酶Q10高产工程菌的基础。
在大肠杆菌中,该酶是由ubiA基因编码,对长链聚异戊二烯焦磷酸底物(PPP)的聚合长度专一性要求不高,对底物的识别具有相对宽广的专一性[13];
而侧链聚异戊二烯焦磷酸的形成则是由聚异戊二烯焦磷酸合成酶所决定的,它催化法尼基焦磷酸(FPP)与类异戊二烯焦磷酸(IPP)的缩合,形成一定聚合度的聚异戊二烯焦磷酸,从而决定了辅酶Q的种类[14]。
在大肠杆菌中,该酶是由ispB基因编码,最终产生CoQ8。
若通过灭活其ispB基因并引入外源性聚十异戊二烯焦磷酸合成酶基因,则有可能在大肠杆菌中构建CoQ10的生物合成的体系。
张安通过酶切,回收所需片断,并经PCR扩增得到了氧化葡萄糖杆菌聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因(ddsA)。
通过测序发现与其他异戊烯焦磷酸合成酶基因
具有同源性(30%~50%),将其克隆到表达型载体上,诱导表达融合载体,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上出现相应的条带。
范怡选择了10种不同的大肠杆菌作为受体菌,用于弱氧化葡萄糖杆菌的聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因ddsA的表达。
通过产物分析证实大肠杆菌能表达出有活性的聚十异戊二烯焦磷酸合成酶,进而合成CoQ10,而且还发现其中1株在大肠杆菌中ddsA的表达量超过了野生型中CoQ8的产量,这就证明了利用大肠杆菌大规
模发酵生产CoQ10的可能性。
因此,筛选出合适的大肠杆菌受体菌对于今后的研究以及工业化生产有重要
意义。
但是在提高CoQ10产量的同时也会伴随着其他辅酶Q的产生,因此还应注意对聚异戊二烯焦磷酸合成酶的酶学性质的研究,及其他相关基因的改造(比如ispB基因的灭活和ubiA基因的强化表达等),进而构建出生产CoQ10的基因工程菌。
微生物细胞内的辅酶Q10的代谢途径非常复杂,
目前所了解的有限信息尚无法根据其代谢合成途径做
全方位合理设计和改造,因此有效提高重组工程菌辅
酶Q10的产量还需大量的研究。
2.3发酵条件的优化
生产菌种只有在最优的发酵工艺条件才发挥其高产的潜能,因此对生产菌种的发酵工艺的优化也是实现高产的一条重要的手段。
发酵工艺的优化主要包括对产CoQ10发酵培养基、培养条件以及培养模式的优化三个方面。
2.3.1发酵培养基的优化
菌种生长的优劣,培养基的成分极其重要,不同菌种,培养基的成分也不同,在CoQ10发酵中可通过选择不同来源成分的碳源、氮源、生长因子、无机盐等进行发酵优化实验,以确定培养基的组成。
实验表明,金属离子,尤其是Mg2+、Fe2+、Mn2+对R.sphaeroides发
有促进作用。
另外,在培养基中添加一定量的其他物质,也能明显提酵生产CoQ10
高CoQ10的产量。
据日本M.G.C.公司[10]报道,在脱氮副球菌的基本培养基中加入胆碱和甜菜碱可提高C
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