分子生物学实验报告Word文档格式.docx
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一、实验原理
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段,送进细胞中去进行繁殖和表达,需要运载工具,携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体(vector)。
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。
作为基因工程的载体必须具备下列条件:
(1)是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖;
(2)载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞量扩增;
(3)载体DNA链上有1到几个限制性切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入;
(4)载体具有选择性的遗传标记,如有抗四环素基因(Tcr),抗新霉素基因(Ner)等,以此知道它是否已进入受体细胞,也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。
细菌质粒具备上述条件,它是基因工程中常用的载体之一。
质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小在1~120kb之间,具有双链闭合环状结构的DNA分子,主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。
它可独立游离在细胞质,也可以整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能存活,而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
质粒在细胞的复制,一般分为两种类型:
严密控制型(stringentcontrol)和松弛控制型(relaxedcontrol)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,染色体不复制时,它也不复制。
每个细胞只含有1个或几个质粒分子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时复制,在细胞里,它有许多拷贝,一般在20个以上。
通常大的质粒如F因子等,拷贝数较少,复制受到严格控制。
小的质粒,如ColEⅠ质粒(含有产生大肠杆菌素E1基因),拷贝数较多,复制不受严格控制。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,染色体DNA复制受阻,而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12-16h,由原来20多个拷贝可扩增至1000-3000个拷贝,此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2%增加到40%-50%。
本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的质粒。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:
培养细菌使质粒扩增;
收集和裂解细菌;
分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基硫酸钠(SDS)可使细胞壁解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在清液中。
用乙醇沉淀、洗涤,可得到质粒DNA。
质粒DNA的相对分子量一般在106-107围,如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×
106,质粒pUC19的相对分子质量为1.7×
106。
在细胞,共价闭环DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA)常以超螺旋形式存在。
如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的力,这种松弛型的分子叫做开环DNA(opencircularDNA,简称ocDNA)。
在电泳时,同一质粒如以cccDNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度快,因此在本实验中,自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。
二、实验目的
1.掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。
2.了解制备原理及各种试剂的作用。
三、实验材料和试剂
材料:
大肠杆菌E.coli,含pBR322质粒。
试剂:
1.LB培养基:
10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/LNaCl,用NaOH调pH至7.3左右。
如固体培养基则添加15g/L琼脂。
2.溶液Ⅰ(pH8.0G.E.T缓冲液):
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA。
灭菌后存放。
3.溶液Ⅱ(0.2mol/LNaOH(含1%SDS)):
预先配制1%SDS母液,临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH,4℃保存。
4.溶液Ⅲ(pH4.8乙酸钾溶液):
5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。
5.酚/氯仿液(V/v=1/1):
酚为重蒸酚,配制时,先将氯仿中加入异戊醇,使其体积比为24:
1,然后等量的加入重蒸酚,混匀,并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物,于棕色瓶中存放,并在上面覆盖等体积的0.01mol/LTris-HCl(pH7.6),4℃保存。
6.无水乙醇
7.70%乙醇
8.pH8.0TE缓冲液:
10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA,其中含RNA酶20μg/mL。
仪器:
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL~lmL)、吸头。
四、操作步骤
(一)培养细菌
将带有质粒pBR322的大肠杆菌接种在含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
注意:
添加Amp时,须待LB培养基冷却到50℃左右方可加入。
(二)从菌落中快速提取制备质粒DNA
1.取1.4mL菌液置于1.5mLEp管中,7500rpm离心1min。
2.弃上清,加入150μLGET缓冲液,在涡旋混合器上充分混匀,在室温下放置10min。
3.加入200μL新配制的0.2mol/LNaOH(含1%SDS),加盖,颠倒(不要振荡)2~3次,使之混匀,冰上放置4min,最多不能超过5min。
4.加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。
加盖后,颠倒数次使之混匀,冰上放置15min。
5.10000rpm离心5min,上清液吸至另一干净的1.5mLEp中,如上清液浑浊则需重新离心一次。
6.于上清液中加等体积酚/氯仿液,振荡混匀,12000rpm离心2min,小心吸取上清液,转移至另一1.5mLEp管中,注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。
7.向上清液加入2倍体积无水乙醇,混匀,室温放置3min。
用离心机于10000rpm离心5min。
倒去上清液。
8.用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次,10000rpm离心3min,除尽乙醇,室温自然干燥(将离心管倒置于一纸巾上),备用。
9.用30uL含无DNA酶的胰RNase(20ug/mL)的TE重新溶解DNA,置于4℃保存,供下午电泳使用。
这里因为要检测质粒是否提取成功以及提取质粒的浓度,故在此要进行一次电泳,下面为琼脂糖凝胶电泳的原理及方法:
原理:
根据DNA分子量不同,采用外加电场使其分开,用EB嵌入DNA分子后在紫外下显荧光。
而荧光强度正比于DNA的含量,如将已知浓度的标准样品表2-1作为电泳对照,就可以估计出待测样品的浓度。
电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照,只需要5-10ngDNA,就可以从照片上比较鉴别。
由于电泳时所用的样品量非常少,只要将浓度控制在几十纳克即可,所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。
表2-1λDNA/HindⅢ中DNA片断
片段
碱基对数目/kb
相对分子质量
DNA含量/%
DNA含量/(ng/mg)
1
23.130
15.0×
106
47.7
476.9
2
9.419
6.12×
19.4
.1
3
6.557
4.26×
13.5
.2
4
4.371
2.84×
9
89.9
5
2.322
1.51×
4.8
47.9
6
2.
1.32×
4.2
41.8
7
0.564
0.37×
1.1
11.6
8
0.125
0.08×
0.3
2.6
总DNA含量为100%
琼脂糖凝胶板的制备
1.琼脂糖凝胶的制备
称取1.0g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入100mLTBE缓冲液,于电炉上加热,注意:
防止溢出,由于琼脂糖较难溶解,如果水分损失较大,则补充一定量的蒸馏水,使其终浓度为1%。
2.胶板的制备
将有机玻璃槽洗净、晾干。
取胶带纸将有机玻璃槽的两端边缘封好,形成一个边脚模子。
将橡皮膏紧贴在有机玻璃槽两端边上,不能留空隙。
将有机玻璃槽置于水平位置,放好样品槽模板(一般称之为梳子),将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶,小心地倒在槽上,控制灌胶速度,使胶液缓慢地展开,直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。
室温下静置1h左右,待凝固完全后,轻轻拔出样品槽模板,撕去胶带纸,胶板上即形成相互隔开的样品槽。
将有机玻璃槽放入电泳槽中,加入0.5×
TBE电泳缓冲液,以盖过胶板为宜。
胶板的样品小槽
3.加样
用移液枪将上述样品分别加入胶板的样品小槽,每次加完一个样品为了避免交叉污染,各样品用不同的枪头,以免造成限制酶被污染。
加样时,枪头不要插入胶板,防止碰坏样品槽周围的凝胶面,每个样品槽的加样量不宜过多,本实验加样为10uL左右。
(每块胶板需点一个Marker,这里即为λDNA/HindⅢ)
4.电泳
加完样品后应立即通电,进行恒压电泳。
在低压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不应高于5V/cm。
当溴酚蓝染料(蓝色)移动到距离胶板下沿约1~2cm处,停止电泳。
5.染色
将电泳后的凝胶浸入EB染液中,进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。
染色20min后,用大量水冲洗。
6.观察
在波长为254nm的紫外灯下,观察染色后的电泳凝胶。
DNA存在处显示出红色荧光条带。
用凝胶自动成像仪处理代替。
五、注意事项
1.收集菌体提质粒前,培养基要去除干净,同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。
2.在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和,采用上下颠倒的方法,千万不能在旋转器上剧烈振荡。
其中加入溶液Ⅱ后,溶液变成澄清,并有黏性;
加入溶液Ⅲ后,出现絮状沉淀。
3.苯酚具有腐蚀性,能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏,使用时应注意。
如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。
4.苯酚可以用于抽提纯化DNA,由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。
所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸,且都必须用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)进行平衡。
所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液,因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。
5.酚/氯仿/异戊醇抽提时,应充分混匀。
经酚/氯仿/异戊醇抽提后,吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入,其中含有蛋白质等杂质。
6.实验中,涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心,而且与之接触的吸头、Ep管,全部弃用,不回收。
7.有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在,但经过多次移接有可能造成质粒丢失。
因此不要频繁转接,每次接种时应挑单菌落。
六、实验结果与分析
提取质粒DNA后,经琼脂糖凝胶电泳,图谱如下:
图中M为Marker,4号为本人所提取的质粒DNA凝胶电泳的检测图,本人所用的质粒为pEGFP-N3。
由跑胶结果可知,质粒DNA分子条带较为明亮,说明所提取的DNA浓度很高;
前面原理部分提到,质粒DNA分子的结构多样,包括超螺旋结构,开环结构以及线性结构等,它们在凝胶中的泳动速度不同,所以在图谱中显示有多条带;
胶孔中比较亮的部分表明提取的质粒中有大量蛋白质残留;
条带非常宽而
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