浅论人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠pJNK表达的影响Word文档格式.docx
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ObjectiveTodiscusstheeffectsofGinsenosideRg1ontheexpressionsofJNKintheratsbraintissueafterfocalcerebralischemia-reperfusionanditssignificance.MethodsRatsweredividedintothesham-operativegroup,Modelgroup,GinsenosideRg1groupsof10mg/kg,20mg/kg,40mg/kg,andNimodipinegroupof1mg/kgatrandom.Themethodofmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)inratswasadoptedtoestablishthemodelofcerebralischemia-reperfusion,andthentheexpressionsofJNKaftercerebralischemia-reperfusion6hwastestedbasedonthechemicalmethodinimmunitytissue.ResultsThepositiverateofexpressionofratsbraintissueineachoftheGinsenosideRg1groupsis(±
)respectively.ConclusionsTheresultsshowedthatthemechanismofGinsenosideRg1toprotectthebraincellsfromdamageaftercerebralischemia-reperfusioninjurymaybeassociatedwithJNKexpressiontoinhibitbraintissue,anditwasmoreeffectivewhenGinsenosideRg1wasinhigh-dose.
Keywords:
GinsenosideRg1;
cerebralischemia-reperfusion;
JNK;
rat
研究表明,人参皂甙Rg1能通过抑制细胞凋亡对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用,但其抗凋亡的机制还不十分清楚[1]。
丝裂原蛋白激酶信号通路(mitogenactivatedproteinkinases,MAPKs)是脑缺血再灌注损伤中主要的信号通路,它包括5个亚家族,其中c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinases,JNKs)亚家族主要参与细胞凋亡的调控。
本实验拟采用免疫组织化学方法检测脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区神经元pJNK的表达,并观察人参皂甙Rg1对pJNK蛋白表达的影响,以明确人参皂甙Rg1是否通过JNK信号通路来抑制脑缺血再灌注后的神经元凋亡。
1材料与方法
实验动物分组与给药方法
Sprage-Dawl大鼠,雄性,体重为250~300g,随机分为6组:
①假手术组;
②单纯缺血再灌注组;
③~⑤人参皂甙Rg1给药组;
尼莫地平药物对照组;
每组5只大鼠。
③~⑥组分别于术前5d至取材当日腹腔注射人参皂甙Rg1、尼莫地平,其余各组分别注射等量等渗生理盐水,1次/d。
药品及试剂
人参皂甙Rg1(纯度95%)购自吉林大学有机化学教研室;
尼莫地平注射液(批号为071001),购自山西亚宝药业;
其它药品均为国产分析纯,由辽宁医学院科学实验中心提供。
大鼠右侧局灶性脑缺血(MCAO)模型的制备
10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉,采用改良线栓法[2]制备大鼠局灶性脑缺血模型。
线栓采用头端光滑烫圆的直径mm鱼线,长度由右侧颈外动脉分叉部计约mm。
栓塞2h后,将鱼线轻轻拔出并缝合皮下筋膜及皮肤,即为再灌注模型,再灌注时间为4h。
免疫组织化学染色及图像分析
MCAO术后6h,将各组大鼠麻醉,4%多聚甲醛灌流固定,断头取脑,梯度酒精脱水,定向石蜡包埋切片,厚5μm。
切片常规脱蜡至水,免疫组化Envision法染色:
3%过氧化氢溶液处理15min以去除内源性过氧化物酶;
然后采用枸椽酸缓冲液高压修复抗原,自然冷却至室温后;
滴加1∶200稀释的pJNK单克隆抗体4℃孵育过夜;
然后滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体37℃孵育30min。
每步骤之间用MPBS洗3次,每次5min。
DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察。
阴性对照用PBS替代一抗[2]。
pJNK蛋白阳性定位于神经元的细胞核,呈棕黄色。
采用CIAS-1000型细胞图像分析系统进行阳性细胞计数。
每例标本等间隔选取切片3张,每张切片随机选取右侧海马CA1区2个不重叠高倍视野(400倍),计数每个视野下细胞总数及阳性细胞数量,计算表达阳性率=%[3]。
统计学分析
应用软件分析,所有数据均用±
s表示。
多组间差异显着性检验采用单因素方差分析及两两比较的q检验。
2结果
pJNK蛋白免疫组织化学定性、定位表达
假手术组大鼠大脑右侧海马CA1区偶见神经元胞核染色;
单纯缺血再灌注组可见大量阳性细胞,与假手术组比较有显着差异();
人参皂甙各组和阳性对照药尼莫地平组能显着降低MCAO大鼠海马CA1区的pJNK阳性细胞数,与单纯缺血再灌注组比较有显着性差异();
人参皂甙Rg110、40mg/kg组与阳性对照药尼莫地平1mg/kg组比较均有显着性差异(),其中40mg/kg组抑制pJNK表达的程度显着优于尼莫地平1mg/kg组,而人参皂甙Rg120mg/kg组与阳性对照药尼莫地平1mg/kg组无统计学差异(),见表1,图1。
表1各组大鼠MCAO术后6h右侧海马CA1区pJNK表达阳性率比较
注:
与假手术组比较,;
与单纯缺血再灌注组比较,;
与尼莫地平1mg/kg组比较,;
与人参皂甙Rg110mg/kg组比较,;
与人参皂甙Rg120mg/kg组比较,
3讨论
研究表明,脑缺血时组织低氧可使细胞发生坏死或凋亡。
JNK家族是MAPK家族成员之一,与细胞凋亡有密切联系[4]。
不论是短暂性还是永久性缺血损伤,JNK信号转导通路在神经元中都被激活,从而发挥重要的作用[5-6]。
WangZQ等利用大脑中动脉永久栓塞(MCAO)模型,证实脑缺血或缺血再灌注后损伤中心脑区JNK的激活主要在损伤后30min~6h,以神经元为主,在损伤中心区和半暗带区磷酸化的JNK显着增多[7-8]。
JNK主要表达于胞质内,核内也有少量表达。
JNK一旦被激活,称为pJNK,立即从细胞质移位至细胞核,并可引起级联反应,导致其一些作用底物相应激活。
首先,pJNK通过对c-Jun氨基末端63与73位的丝氨酸进行有效的磷酸化而激活c-Jun。
活化的c-Jun可以聚合成二聚体而形成可以活化的蛋白-1(AP-1)复合物,这种复合物通过与其靶DNA结合相结合激活下级基因而发挥其抗凋亡作用[9]。
本实验结果显示:
假手术组有少量pJNK阳性细胞;
与假手术组比较,单纯缺血再灌组大鼠海马CA1区神经元可见大量pJNK阳性细胞,差异有统计学意义(),这一实验结果与以往文献报道基本一致;
人参皂甙Rg1三个剂量组与单纯缺血再灌注组比较,pJNK的表达明显减少,提示人参皂甙Rg1具有抑制脑缺血再灌注大鼠pJNK的作用。
人参皂甙Rg1各组分别与阳性对照药尼莫地平组比较,人参皂甙Rg110mg/kg组虽能抑制神经元pJNK的表达,但与阳性对照药尼莫地平组比较仍显着性差异(),而人参皂甙Rg120、40mg/kg组与阳性对照药尼莫地平组无统计学差异(),此结果提示人参皂甙Rg1中、高剂量组的效果在抑制pJNK蛋白表达方面具有与尼莫地平相似的效果。
本结果提示人参皂甙Rg1具有抑制pJNK蛋白表达的作用,但其能否通过抑制JNK信号通路减少脑缺血再灌注损伤引起的神经元凋亡,以发挥其对缺血性脑损伤的保护作用尚需进一步证实。
【参考文献】
[1]王海波,李源莉.人参皂甙Rg1神经保护作用的研究进展[J].白求恩军医学院学报,2008,6:
291-293.
[2]张铭,司少艳,韩瑞刚,等. 免疫组化SP法与PicTureTM两步法的比较[J].诊断病理学杂志,2004,11
(1):
58-59.
[3]王凤岩,夏潮涌.组织原位肿瘤细胞DNA含量与倍体分析的某些方法学问题[J].中华病理学杂志,2000,29(5):
381-382.
[4]FarrokhniaN,RoosMW,Teré
ntA,etal.Differentialearlymitogen-activatedproteinkinaseactivationinhyperglycemicischemicbraininjuryintherat[J].EurJClinInvest[J].2005,35(7):
457-463.
[5]GinetV,PuyalJ,MagninG,etal.Limitedroleofthec-JunN-terminalkinasepathwayinaneonatalratmodelofcerebralhypoxia-ischemia[J].JNeurochem,2009,108(3):
552-562.
[6]BorselloT,ClarkePG,HirtL,et peptideinhibitorofc-JunN-terminalkinaseprotectsagainstexcitotoxicityandcerebralischemia[J].NatMed,2003,9(9):
1180-1186.
[7]RepiciM,CentenoC,TomasiS,etal.Time-courseofc-JunN-terminalkinaseactivationaftercerebralischemiaandeffectofD-JNKI1onc-Junandcaspase-3activation[J].Neuroscience,2007,150
(1):
40-49.
[8]FerrerI,FrigulsB,
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