新一代测序技术在肿瘤临床中的应用张蒙Word文档格式.docx
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张濛,张青云,徐国宾(北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所检验科,恶性肿瘤发病机制及转化研究
教育部重点实验室,
北京100142摘要:
随着测序技术的不断发展,成本低、速度快、通量高的新一代测序(NGS技术在肿瘤临床领域显现出很高的应用价值。
本文对NGS在肿瘤临床中的应用和研究进行了综述,主要包括检测胚系突变和单核苷酸多态性用于肿瘤预测预防,检测血浆中循环肿瘤DNA(ctDNA用于肿瘤的早期诊断,基于NGS的单细胞测序技术检测体细胞突变用于指导个体化、靶向治疗及疗效预测。
同时也简要介绍了NGS技术在临床应用中面临的挑战,为其更好地服务于临床提供思路。
关键词:
测序;
新一代测序;
高通量测序;
肿瘤;
基因;
临床应用中图分类号:
R730
文献标志码:
A
新一代测序(next-generationsequencing,NGS又称二代测序、高通量测序(high-throughputsequen-cing或大规模平行测序(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS,是相对于第一代测序———桑格测序(Sangersequencing而言的。
本文简要介绍NGS技术,并对该技术近年在肿瘤临床领域中的应用做一综述。
1
NGS技术简介
2005年,Roche公司首先推出了第一台高通量测序仪。
目前,高通量测序平台主要有3类:
Roche公司的GSFLX测序系统,
Illumina公司的Solexa基因组分析仪和ABI公司的SOLiD测序仪。
3类测序平台原理各异。
Illumina公司利用桥式PCR扩增的方法,将DNA片段固定到流动池(flowcell中,每次加入不同荧光素标记的4种碱基中的一种,边合成边测序,用高分辨率CCD(charge-coupleddevice采集数据,将荧光颜色信号转换为DNA序列。
Roche公司利用磁珠吸附DNA分子,再乳化成微滴进行PCR扩增,连接着扩增产物的磁珠被加入到PTP板(PicoTiterPlate中,测序开始后每次反应加入4种碱基中的一种,当配对的碱基合成到引物上时,释放焦磷酸分子,将荧光素氧化发出荧光,通过检测荧光信号的有无达到测序的目的。
ABI公司的SOLiD测序仪采用的则是连接测序法,
DNA片段被固定到磁珠表面,随后形成油包水的微滴进行PCR扩增,扩增结束后磁珠共价结合到SOLiD玻片表面,随后加入4种荧光染料标记的8种碱基单链探针,每次反应向引物上连接一种探针,仪器记录下该探针的荧
光信号后,
酶切掉后面的3个碱基和荧光基团,为下一个探针的掺入做好准备。
由于SOLiD采用了“双碱基编码技术”
在测序过程中对每个碱基都检测了两遍,从而提高了原始数据的质量。
3个系统的详细实验流程及优缺点比较可参看文献[1]。
2
NGS技术在肿瘤风险预测及预防中的应用NGS技术可使肿瘤防治措施前移至预防阶段。
大量研究证明某些肿瘤的发生与个别关键基因突变相关。
乳腺癌相关基因见表1
[2]
其中一些基因突
变除与乳腺癌相关外,还与其他肿瘤发生有关。
乳腺癌易感基因(breastcancersusceptibilitygene,BRCA变异最早被发现与女性的乳腺癌和卵巢癌发病有密切的关系。
BRCA1/2属于抑癌基因,正常细胞中,
BRCA1/2可以帮助修复DNA损伤并维持DNA稳定性,防止细胞恶变。
但当BRCA1/2基因发生变异后,细胞失去了这一保护作用,发生癌变的概率将大大增加。
BRCA2基因变异与男性乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌发生同样关系密切。
著名影星安吉丽娜·
朱莉自称已接受预防性双侧乳腺切除术,因她本人通过基因检测发现自己携带有BRCA1突变基因,且她母亲在56岁时死于乳腺癌,医生估计她患上乳腺癌的风险高达87%,患上卵巢癌的风险高达50%,而切除术后,她患上乳腺癌的风险已降至5%。
今后,有与安吉丽娜·
朱莉一样有癌症家族史的女性可以借助NGS技术进行BRCA检测,提早采取措施或增加体检次数来预防。
但NGS技术用于普通人群的癌症基因筛查,其临床意义还有待商榷。
表1与乳腺癌发病相关的基因[2]
外显率基因名称终身患乳腺癌风险(%其他部位相关肿瘤
高BRCA14080卵巢癌
BRCA24080卵巢癌,前列腺癌,胰腺癌,男性乳腺癌
CDH13050弥漫型胃癌
LKB13254卵巢生殖索肿瘤,宫颈恶性腺瘤,子宫、睾丸、小肠、胰腺、结肠、胃癌PTEN2550甲状腺、子宫内膜癌
TP535690肉瘤,白血病,脑、肾上腺皮质肿瘤
中ATM2030胰腺癌
BRIP11530
CHEK22030
PALB22040胰腺癌
对于遗传性乳腺癌、卵巢癌和其他癌症,2014版美国国立综合癌症网络(NCCN指南中明确指出可利用NGS技术检测相关的基因突变。
这些基因被推荐用于BRCA1/2基因阴性且家族史有一种或多种高危综合征的患者(如CDH1基因突变引起的遗传性弥漫型胃癌综合征,STK11/LKB1基因突变引起的黑斑息肉综合征,错配修复基因突变或EPCAM基因缺失引起的林奇综合征。
这类基因有21个:
ATM、BARD1、BRIP、CDH1、CHEK1、CHEK2、MLH1、MSH2、MSH6、MUTYH、MRE11A、NBN、PALB2、PMS2、PTEN、RAD50、RAD51B、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53[3]。
除上述关键基因外,肿瘤易感性还与基因多态性相关。
基因多态性是指在一个生物群体中,同时和经常存在两种或多种基因型(genotype或等位基因(allele,也称遗传多态性(geneticpolymor-phism。
它决定人与人之间的个体差异,也决定了某些人患某种疾病的风险。
这些多态性位点为数众多,大约占人类基因组的1%,对人类疾病易感性的影响也异常复杂。
以乳腺癌为例,与乳腺癌易感性相关的单核苷酸多态性(SNP位点就包括rs11571833、rs11552449、rs9790517、rs2046210、rs2236007、rs2588809、rs941764等。
目前,国内外一些测序公司通过检测某些疾病相关基因(包括有热点突变的基因和多态性位点,对一些常见病风险进行评估,计算出患某病的百分比。
但这些测序服务存在诸多问题。
首先,测序公司所选取的基因除少数临床意义较明确外,大多数都缺乏多中心、大样本的临床数据支持和基础实验验证,以此推算出的患病风险并不一定准确;
另外,各个公司在预测某项疾病时所选取的多态性位点也千差万别,预测结果经常互相矛盾;
最后,测序公司直接向不具备专业知识的普通大众提供检测结果,致使对结果的解释异常混乱。
正是基于以上原因,2013年底美国食品药品监督管理局(FDA叫停了“23andMe”公司提供的基因测序服务。
但此次叫停的仅仅是“23andMe”公司直接面向用户的基因检测服务,其他医疗机构(结果并不直接面对患者而是面对医生及科研机构中的测序服务并不在此次叫停之列。
3NGS用于肿瘤诊断
NGS能对血浆中的循环肿瘤DNA(ctDNA进行高敏感性、高特异性的检测。
ctDNA是一种具备广泛应用前景的肿瘤标志物,与组织学检测相比,具有取材方便、无创、患者依从性好、可连续监测等优点。
2014年4月6日在《NatureMedicine》发表的一篇文章指出,将NGS技术应用于血浆ctDNA检测,具有惊人的高敏感性和高特异性。
作者将此法命名为CAPP-Seq(深度测序肿瘤个体化建档法,cancerpersonalizedprofilingbydeepsequencing[4]。
研究者对不同级别的肺癌患者进行了CAPP-Seq验证,发现对ⅡⅣ期的非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC检测敏感性达100%,Ⅰ期的NSCLC中敏感性为50%;
对各期肺癌的特异性均为96%。
在ⅡⅣ期和所有分期的肺癌中,ROC曲线下面积分别为0.99和0.95。
研究还表明,当ctDNA比例低至0.019%的时候仍能够被CAPP-Seq检测到。
与传统活组织检查法在筛查基因型(EGFR和KRAS的对比时发现,分别对10例样本(7例阳性和3例阴性进行活检和CAPP-Seq检测,结果显示CAPP-Seq并不比金标准肿瘤活检的诊断效能差,能够准确测定肺癌的基因型。
NGS较第一代测序在肿瘤诊断方面表现出超高的敏感性和特异性,原因主要有两个。
首先,对于肿瘤这种复杂的多基因病来说,希望靠单基因突变就试图对其诊断和分型是非常困难的,传统的第一代测序只能一个基因、一个基因地进行检测,而NGS技术能对多个基因同时进行检测,多基因组合
大大提高了对肿瘤诊断的敏感性和特异性。
其次,NGS技术本身检测基因突变的灵敏度就高于第一代测序。
目前公认的第一代测序检测突变的灵敏度大约在20%,即对于那些突变比例低于15%20%的肿瘤标本,第一代测序很难发现。
而NGS技术由于引入了测序深度(sequencingdepth这一概念,使其可以检测到低于0.5%的突变。
测序深度是指测序得到的碱基总量(bp与目的基因组(genome大小的比值,是评价测序量的指标之一。
测序深度越深,对突变检测的灵敏度也越高。
NGS还能检测血浆中ctDNA的甲基化状态和拷贝数变异(copynumbervariation,CNV。
对于非转移性的肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、平滑肌肉瘤和神经内分泌肿瘤的诊断而言,检测血浆ctDNA甲基化的敏感性和特异性可达74%和94%。
同时,检测血浆ctDNA的甲基化还可用来监测肝细胞癌患者的术后复发。
联合检测ctDNA的甲基化和CNV诊断肿瘤的敏感性和特异性可达到87%和88%。
NGS技术在肿瘤诊断中的另一个例子是刚刚兴起的单细胞测序技术。
2011年,《NatureMeth-ods》将其列为年度最值得期待的技术之一[5],2012年该技术又被《Science》列为年度最值得关注的六大领域之首[6]。
由于常规测序样品的来源均是多细胞混合DNA,这种方法得到的全基因组序列信息是一群细胞基因信息的平均值,或其中占优势数量的细胞信息,而单个细胞的特性则被忽视。
单细胞组测序技术是将分离的单个细胞中微量的全基因组DNA进行无选择性地扩增,获得高覆盖率的完整的基因组之后再通过NGS技术对其进行测序,从而揭示细胞个体间差异。
但由于PCR扩增时存在偏倚,常导致测序结果的基因组覆盖度很低。
哈佛大学谢晓亮团队开发出的多重退火和成环循环扩增技术(multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,MALBAC能有效降低PCR扩增过程中的偏倚,该技术利用一组包含8个碱基可变区和27个碱基共同序列的随机引物进行扩增,使得前5个PCR循环的产物能自身成环,在进入指数扩增时将所有环状产物打开,同时进行扩增,从而有效降低了扩增偏倚,使得MALBAC扩增的DNA基因组覆盖度达到93%[7]。
2012年,华大基因同样利用单细胞测序技术分析了单个肾癌细胞的单核苷酸突变特征,从而在更高的分辨能力上为评价基因改变的复杂性提供了更为优化的方法[8]。
2014年,他们又用该方法在结肠癌中发现了一个新的癌基因SLC12A5[9]。
单细胞测序技术不仅为肿瘤分子分型和个体化治疗提供指导,还将有助于我们理解肿瘤内部的异质性和肿瘤的演进[10-11]。
单细胞测序技术还能与循环肿瘤细胞(cir
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- 新一代 技术 肿瘤 临床 中的 应用