高氧诱导新生鼠急性肺损伤模型的制备及其机制探讨Word格式.docx
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高氧诱导新生鼠急性肺损伤模型的制备及其机制探讨Word格式.docx
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,肺组织NF-κB活性上升(t=,P&
,肺组织见小血管扩张、充血和肺泡内少量出血及以中性粒细胞、巨噬细胞为主的炎性细胞浸润;
7d时,高氧组BALF中MDA、TNF-α含量进一步升高(t别离=、,P均&
,SOD活性进一步下降(t=,P&
,NF-κB染色强度进一步升高(t=,P&
,肺组织充血、水肿,间质内浸润的中性粒细胞、巨噬细胞等增多,肺泡距离轻度增宽,肺组织结构紊乱。
结论 新生鼠持续暴露于高浓度氧气可制备新生儿高氧急性肺损伤动物模型。
高浓度氧致脂质过氧化,抗氧化酶系统活性降低,NF-κB过度活化,TNF-α过度释放,氧化/抗氧化系统失衡和过度炎症反映是肺损伤的重要发病机理。
【关键词】高氧;
肺损伤;
疾病模型;
动物;
核因子-κB
AbstractObjectiveToestablishanoptimalanimalmodelofoxygen-inducedacutelunginjury(ALI)inneonate,andtostudythepossibleunderlyingmechanism.Methods Persistenceexposureof90%~95%oxygenresultinginALIwaspracticedinneonatalSprague-Dawley(SD)rats.Atthethirddayandseventhdayofexposure,malondialdehyde(MDA),superoxidedismutase(SOD)andTNF-αinbronchoalveolarlavagefluid(BALF)weredeterminedandtheintensionofnuclearfactor-κB(NF-κB)expressioninratlungwasanalyzedbythemethodofimmunohistochemistry,andlunghistopathologicalchangeswereexaminedinhyperoxicgroupandcontrolgroup.Results After3days,comparedwiththecontrolgroup,hyperoxicgroupshowedALIcharacterizedbytheincreaseintheconcentrationofMDA,TNF-αinBALFandtheintensionofNF-κBinratlungwhilethedecreaseintheactivityofSODinBALF(t=,,,,P&
andpresenceofcongestion,edema,inflammatoryinfiltration.After7days,continuousincrease
intheconcentrationofMDA,TNF-αinBALFandtheintensionofNF-κBinratlungandcontinuousdecreaseintheactivityofSODinBALFwereobserved(t=,,,,P&
,andlunghistopathologicalpresenceshowedmoreseverechangesinhyperoxicgroup. Conclusions Anoptimalanimalmodelofoxygen-inducedALIinneonatewasestablishedbypersistenceexposureof90%~95%oxygenwithneonatalS-Drats.Excessesoflipidperoxidation,decreaseofactivityofantioxidase,increaseofactivityofNF-κBandexcessreleaseofTNF-αareassociatedwithhyperoxia.Themechanismsofimbalanceofoxidant/antioxidantandinflammationmayplayimportantrolesinthedevelopmentof早在1967年Northway就第一次提出新生儿高氧性肺损伤的概念。
目前在新生儿领域,高氧肺损伤越发引发人们的重视,可是至今关于高氧肺损伤的确切机理及其干与方法仍未取得理想进展。
成立一种适合的动物模型是进行高氧性肺损伤研究的前提。
本次研究以新生Sprague-Dawley(SD)大鼠制备科学、简易、经济的新生儿高氧急性肺损伤动物模型,并探讨其发病机制。
1 材料与方式
实验动物 2005年4月至2006年1月生后3d新生SD大鼠48只,体重~,平均(±
)g,性别不限,新生鼠未断奶,与哺乳母鼠一起饲养,系清洁级动物,苏州大学动物实验中心提供。
成立高氧环境 自制25cm×
25cm×
35cm的有机玻璃容器,顶部一进气孔(直径),侧面有等大的排气孔,进气孔持续通入纯氧,测氧仪(由浙江利达仪器厂生产)持续监测箱内氧浓度,使氧浓度维持在90%~95%。
容器内置有饲料、水、钠石灰250g(由上海陆都化学试剂厂生产)和垫料。
环境温度22~26℃,相对湿度维持60%~70%。
实验动物分组及处置 生后3d新生SD大鼠48只编号、称重后随机分为对照组和高氧组,每组24只。
高氧组新生鼠置于上述高氧环境。
对照组新生鼠那么置于同一室内,同意常压空气。
高氧组天天开箱两次(改换垫料、钠石灰、水及饲料,并与空气组互换母鼠以幸免母鼠因氧中毒致护理能力下降,两次开箱总时刻不超过1h)。
实验指标检测
支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluidBALF)中指标检测实验3d和7d后,腹腔注射戊巴比妥钠(90mg/kg)麻醉后放血处死。
经气管插管并向导管内注入4%氯化钠注射液灌洗3次,将灌洗液于离心半径8cm,2500r/min离心10min,取上清液备测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性,和(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)(ELISA法)。
MDA试剂盒、SOD试剂盒(由南京建成生物工程研究所生产),TNF-αELISA试剂盒(由上海晶美生物工程生产)。
肺组织病理切片 将未灌洗的动物麻醉处死,打开胸腔,取左肺迅速浸泡于10%中性福尔马林液中,石蜡包埋、切片,HE染色,光镜观看。
肺组织核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)检测采纳S-P法,兔抗大鼠NF-κB(p65)抗体(由武汉博士德生物工程生产)、SP超敏试剂盒(由福州迈新生物技术开发生产)。
细胞核和(或)胞浆呈棕色即阳性细胞。
400倍物镜下每张切片随机选5个视野,用图像分析系统(由德国LEICA公司生产,型号Q550CW)分析相对灰度,相对灰度越小,染色强度越大。
统计学方式 采纳SPSS统计学软件包进行处置与分析。
计量资料采纳均数±
标准差(■)表示,组间比较行方差分析及t查验。
设P<为不同有统计学意义。
2 结果
BALF中MDA、总SOD、TNF-a及肺组织NF-κB染色强度转变见表1
由表1可见,高氧暴露3d,BALF中MDA、总SOD、TNF-a及肺组织NF-κB染色强,高氧组与对照组比较,不同均有统计学意义(t别离=、、、,P均<;
7d时上述指标高氧组与对照组比较,不同均有统计学意义(t别离=、、、,P均<。
病理表现见封二图4~6 高氧组3d时见小血管扩张、充血和肺泡内少量出血及炎性细胞浸润;
7d时高氧组毛细血管扩张,充血,组织水肿,炎性细胞浸润加重,肺泡距离轻度增宽,肺组织结构紊乱。
3 讨论
临床医治中,吸入高浓度的氧气是一种常见和必要的方法。
可是长时刻高浓度氧气吸入对多个器官和系统均具有毒性作用[1],关于早产新生儿或本身存在疾病的新生儿尤其突出。
早在1967年Northway就第一次提出新生儿支气管肺发育不良(bronchopulmonarydysplasia,BPD)的概念,并推测其发生与长时刻吸入高浓度氧有紧密关系。
可是,高氧肺损伤的确切机理至今仍未说明。
新生SD大鼠在组织发育、病理生理、免疫反映等方面与新生儿有很强相似性,利用新生SD大鼠成立高氧肺损伤模型并在此基础上的实验研究具有科学性、可行性。
SD大鼠生后肺发育分为三期,即膨胀期(生后1~4d)、肺泡化期(4~13d)和平稳生长期(14~21d)。
新生儿时期肺发育处于肺泡时期[2],相当于SD大鼠肺泡化期。
本次研究对象为生后3~10d的新生SD大鼠,维持了实验模型与临床病理生理较高相似度。
氧浓度维持在90%~95%,选择该浓度的缘故在于能够较短时刻造成急性肺损伤。
本次研究对以往的中断监测作了改良,作持续监测,幸免氧浓度不稳固对实验结果产生不利阻碍。
氧浓度在每日开舱改换饲料、垫料和母鼠的进程中舱内的氧浓度会迅速下降,这是模型成立的一个不利因素,可是在本次研究中每日开舱时刻操纵在1h之内,使新生SD大鼠绝大多数时刻处在高氧环境中;
考虑到高浓度的氧也会对母鼠造成损伤,造成其护理能力的下降,在本次研究中每日将氧舱中的母鼠与空气中的母鼠进行互换,如此既幸免母鼠护理能力的下降,又使各组的条件尽可能齐同。
检测指标和病理学检查清楚显示高氧组新生SD大鼠呈现急性肺损伤,本次研究成功成立新生儿高氧急性肺损伤的动物模型。
MDA是脂质过氧化产物,而SOD是机体重要的抗氧化酶系,同时检测这两项指标能够必然程度反映机体氧化/抗氧化平稳。
本次研究中高氧组BALF中MDA含量高于对照组,总SOD活性低于对照组(P均&
),提示高氧引发脂质过氧化损伤和机体抗氧化酶活性降低,氧化/抗氧化失衡。
目前许多研究说明,炎症反映也是高氧肺损伤的重要机理之一[3]。
TNF-α是一重要促炎因子,NF-κB是炎症反映中重要的转录因子。
TNF-α通过一系列复杂的信号转导途径激活NF-κB[4],激活了的NF-κB又可进一步增进TNF-a表达上调,形成正反馈,加重肺损伤。
本次研究中高氧组TNF-α增加,免疫组化提示NF-κB活化,进一步验证炎症反映在高氧肺损伤中的发挥重要作用。
与对照组相较,高氧组BALF中MDA、SOD、TNF-α的转变,结合免疫组化NF-κB检测和病理学检查结果,清楚地说明:
高氧暴露仅3d即诱发新生SD大鼠急性肺损伤;
随时刻延长,7d时肺
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- 诱导 新生 急性 损伤 模型 制备 及其 机制 探讨