973课题的结题总结报告-农业Word下载.doc
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课题负责人:
翟文学
子课题负责人:
翟文学彭开蔓(王石平)
承担单位:
中国科学院遗传所,华中农业大学
电子信箱:
wxzhai@,
swang@
2003年9月30日
一、计划任务完成情况
本课题的预期目标是分离克隆2个水稻抗病基因。
我们已经按计划开展了研究工作,分别对水稻抗白叶枯病基因Xa3、Xa4、xa5、xa13、Xa25(t)和Xa26以及抗稻瘟病相关基因进行了克隆研究。
目前已克隆并证实了Xa26基因;
已克隆Xa4和xa5基因,即将证实其功能;
精细定位了Xa3、xa13和Xa25(t)基因;
获得了3个抗稻瘟病相关基因。
基本达到预期研究目标。
具体工作与取得的进展如下:
1.精细定位了水稻抗白叶枯病基因Xa4和Xa26
我们利用F2大群体,分别对水稻抗白叶枯病基因Xa4和Xa26进行了遗传分析和精细遗传定位。
这两个基因都位于第11号染色体的长臂末端并紧密连锁。
涉及Xa4基因(Sunetal.,2003,Theor.Appl.Genet.106:
683-687)和Xa26基因(Yangetal.,2003,Theor.Appl.Genet.106:
1467-1472)遗传分析的工作已发表。
2.分离克隆了水稻抗白叶枯病基因Xa26
我们采用图位克隆法从水稻品种明恢63中分离克隆了Xa26基因(专利申请号:
02139212.9)。
序列分析发现这该基因编码LRR受体激酶类蛋白质。
研究还发现,无论是在苗期还是成株期携带Xa26基因的转基因水稻的抗谱比Xa26基因的供体水稻品种(明恢63)的抗谱显著增宽,抗性明显增强,说明遗传背景可能影响抗病主效基因的作用。
分离克隆Xa26基因的工作正在发表印刷之中(Sunetal.,2003,PlantJ.,inpress)。
另外,研究还发现携带抗白叶枯病基因Xa3的近等基因系IRBB3和携带抗白叶枯病基因Xa22(t)的云南地方稻品种扎昌龙也携带Xa26基因。
因为Xa3和Xa22(t)基因也被他人定位于第11号染色体长臂末端,推测Xa26、Xa3和Xa22(t)是同一个基因,这部分验证工作正在进行之中。
3.分离克隆了水稻抗白叶枯病基因Xa4
我们采用图位克隆法从水稻近等基因系IRBB4中分离克隆了Xa4基因(专利申请号:
02139257.9)。
序列分析发现这该基因也编码LRR受体激酶类蛋白质。
Xa4和Xa26属于同一个基因家族的不同成员。
抗性分析发现发现籼稻品种特青和93-11与IRBB4的抗谱相同,序列分析发现特青和93-11也携带Xa4基因。
转基因初步实验结果显示遗传背景可能也影响Xa4基因的抗性。
目前,这部分工作正在完善之中。
4.分析了Xa4和Xa26所属基因家族的进化
Xa4和Xa26基因所属家族(命名:
Xa26基因家族)包括10个成员。
我们对水稻品种明恢63和特青包含Xa26基因家族的大约100kb区段进行了测序,对比公共数据库中的水稻品种日本晴和93-11的同源区段的序列,分析了抗病基因的进化模式。
涉及这部分工作的论文正在撰写之中。
5.鉴定并精细定位了一个水稻抗白叶枯病新基因Xa25(t)
在杂交水稻恢复系明恢63中鉴定了一个新的抗白叶枯病显性基因Xa25(t)。
该基因在苗期和成株期都能特异性的抗白叶枯病菌生理小种PXO339。
通过分析携带Xa25(t)基因的重组自交系群体,将该基因定位于水稻第12号染色体的着丝粒区。
在该着丝粒区段已经定位了多个水稻抗稻瘟病基因,推测Xa25(t)基因与抗稻瘟病基因紧密连锁或等位。
涉及Xa25(t)基因的研究工作已发表(Chenetal.,2002,Phytopathology92:
750-754)。
6.构建了水稻全生育期平衡化cDNA文库
利用水稻品种明恢63,构建了全生育期平衡化cDNA文库。
该文库由水稻不同生长时期和不同生理状态下的15种不同组织的cDNA组成,包括白叶枯病菌和稻瘟病菌接种诱导后的组织。
该文库包含大约62,000个克隆,平均插入片段为1.4kb(Chuetal.,2003,ChineseScienceBulletin48:
229-235)。
对该文库中的大约4万个cDNA克隆进行了测序,获得两万多个非重复EST序列。
利用该文库我们建立了高效cDNA芯片(包括cDNAarray和cDNAmicroarray)分析体系。
7.发展了一种新的EST聚类方法
我们发展了一种新的计算机分析方法,用于分析大规模EST测序中所产生的大量数据,以获得高质量、非重复表达序列。
该方法在聚类过程中采用MEGABLAST工具对一致序列进行序列同源比较,并用phrap程序对每一EST簇进行拼接检验。
这一聚类策略能降低测序错误带来的影响,有效识别基因家族成员,并避免选择性剪接的干扰。
与NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的UniGeneclustering方法相比,ESTClustering的聚类结果可以更好地反映表达序列的多样性。
涉及这部分工作的论文已经发表(张利达等,2003,遗传学报30:
147-153)。
8.克隆获得了一批水稻抗性基因同源序列
利用植物NBS-LRR类抗性基因的高度保守区设计PCR引物从水稻基因组中扩增同源序列,经克隆测序确定后获得了23个不同的NBS片段(称为抗性基因同源序列,简记为RS)。
将这些RS序列在窄叶青/京系17的重组自交系(RIL)构建的分子图谱上定位,定位结果表明它们分布在1,3,4,7,8,9,10和11染色体。
其中10个RS位于已知R基因所在的染色体区间。
这些RS标记可以作为图位克隆同一位点上相应抗病基因的起点。
有关结果已发表(Zhengetal,2001,CIENCEINCHINA(SeriesC),44(3):
253-262)。
9.构建了含Xa4、xa5和xa13三个抗性基因的IRBB56基因组BAC文库
利用含Xa4、xa5和xa13三个水稻白叶枯病抗性基因的累加系IRBB56构建了一个水稻细菌人工染色体文库。
该文库包含55296个克隆,平均插入片段为132kb。
按水稻基因组为450Mb计,该文库覆盖14倍基因组,筛选出任一水稻基因或序列的概率为99.99%。
用均匀分布的3个叶绿体基因和4个线粒体基因克隆作探针筛选文库,结果显示该文库中含细胞器基因组DNA同源序列的克隆数小于1%。
用分布于水稻3条不同染色体、分别与Xa4、xa5和xa13连锁的DNA标记筛选文库,分别检测出11--106个阳性克隆,为克隆这些基因打下了基础。
该文库对水稻基因组的高度覆盖率和较大的插入片段,非常适合于物理作图和基因的分离和克隆(王文明等,2001,遗传学报,28
(2):
120-128;
Wangetal.,2001,MolecularGeneticsandGenomics,265:
118-125)。
本研究中建立的提取高质量水稻基因组DNA方法和高效转化方法被成功地用于中国超级杂交稻测序(Science,2002,296:
79-92)。
10、克隆了一个NBS-LRR类抗性基因家族
用水稻抗白叶枯病基因Xa4的近等基因系和基因累加系对克隆的NBS-LRR同源序列RS13进行RFLP分析,发现序列RS13来自Xa4基因位点(Wangetal,2000,ChineseScienceBulletin,45(19):
1779-1782)。
利用克隆的抗病同源序列RS13作为探针,从水稻IR64的BAC文库中筛选到4个阳性克隆,其中一个克隆14E19能够覆盖其余3个克隆。
对14E19进行了全序列测定和分析,获得了73kb的全长DNA序列,基因预测显示其上有4个编码NBS-LRR的基因,分别命名为NL-A-D。
同时,对近等基因系IRBB56同一基因组位置的BAC克隆106P13进行分析,发现其上有10个NL同源拷贝,其中有4个同14E19上的NL一样,说明NL是一个至少有10个成员(分别命名为NL-A—NL-J)的基因家族。
搜索日本晴、93-11、广陆矮4号的序列,发现三者也有多个高度同源的序列。
对NL基因进行RT-PCR和cDNA库筛选分析,发现NL-B能够在含抗白叶枯病基因Xa4水稻品系IRBB4中特异表达,说明NL-B参与了白叶枯病抗性反应。
把这些同源拷贝作为新的抗病基因进行研究,转基因实验正在证实这些同源拷贝的功能。
11、定位克隆了隐性抗白叶枯病基因xa5的候选基因
本研究利用RFLP、CAPS等标记方法对xa5近等基因系IR24和IRBB5构建的F2群体共5000个单株进行群体连锁分析,构建了xa5的精细遗传图谱。
在此基础上我们用与xa5基因紧密连锁的标记筛查含有xa5的水稻累加系IRBB56的BAC文库,构建了包含xa5基因位点的精细物理图谱(Zhongetal,ChineseScienceBulletin,inpress)。
将xa5限定在12kb的片段上,在此区间发现唯一一个候选基因,与已知抗病基因具有不同的结构。
该基因与显性等位基因编码的氨基酸序列有差异。
目前功能互补实验已获得转基因植株。
12.开展了抗白叶枯病基因Xa3和xa13的精细定位与图位克隆
本研究利用IR24与含Xa3基因的近等基因系IRBB3组合构建了约2000单株的F2定位群体,并利用国际水稻基因组和中国超级杂交稻基因组计划所公布的第11染色体长臂上的序列设计出一系列SSLP和CAPS标记,对Xa3进行精细定位,将Xa3基因定位于CAPS标记Y3和SSR标记RM144之间,距Y3约0.25cM,距RM144约1.0cM。
目前,我们又利用日本晴和IRBB3组合构建了约5000单株的F2群体,对Xa3基因作进一步精细定位。
利用xa13的近等基因系构建了包含4000单株的F2群体,将xa13基因界定在第8染色体80Kb的区间。
对这个区间进行DNA测序和基因预测,发现了可能的候选基因,正对这些候选基因进行共分离分析和功能互补分析,有望获得突破。
13、分离克隆了抗稻瘟病相关基因
本研究利用cDNA-AFLP和组池分离分析(BSA)相结合的方法来检测稻瘟病抗池和感池中特异表达的基因。
在大约20122个检测到的位点中,一共获得了12个差异表达的条带(DEBs),8个来自抗池,4个来自感池。
利用水稻的DH群体对它们进行遗传定位结果表明其中的5个DEBs,R1,R8,S9,S16和S17被定位在第一染色体的一个抗稻瘟病的QTL所在的区间。
序列分析和等位分析发现R1和S16,R8和S9分别来自二对等位基因位点,而且R1(S16),S17和R8(S9)分别位于第一染色体上三个紧密相连的BAC/PAC克隆中,这更进一步证实了R1(S16),S17和R8(S9)在第一染色体上QTL包含区间中的紧密连锁关系。
逆向NorthernBlotting和定量RT-PCR分析表明R1(S16),S17和R8(S9)在接种稻瘟病菌后的表达水平都是上调的,这暗示它们都参与了稻瘟病抗性反应过程。
有关结果已投送国际学术刊物。
二、研究水平与创新性
本研究是在基因的水平上发掘水稻的抗病种质,重点是克隆符合“基因对基因”假说的,以过敏性抗病反应为基础的水稻抗病基因。
已克隆的多种植物的抗病基因在序列结构上分为五种类型,而迄今正式见诸于报导的克隆的水稻抗病基因只有4个,即抗白
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