十体外哺乳动物细胞基因突变试验文档格式.doc
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在加入和不加入代谢活化系统的条件下,使细胞暴露于受试物一定时间,然后将细胞再传代培养,突变细胞在含有6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine,6-TG)或三氟胸苷(trifluorothymidine,TFT)的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。
基于突变集落数,计算突变频率以评价受试物的致突变性。
6试验方法
6.1试剂和受试物制备
6.1.1受试物
6.1.1.1受试物的配制:
固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中,用前稀释至适合浓度;
液体受试物可以直接加入试验系统/或用前稀释至适合浓度。
受试物应在使用前新鲜配制,否则就必须证实储存不影响其稳定性。
6.1.1.2溶剂的选择:
溶剂必须是非致突变物,不与受试物发生化学反应,不影响细胞存活和S9活性。
首选溶剂是水或水溶性溶剂。
二甲基亚砜(DMSO)也是常用溶剂,但使用时浓度不应大于0.5%。
6.1.1.3受试物浓度设置
6.1.1.3.1最高浓度的选择:
决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度(osmolality)的改变。
6.1.1.3.2细胞毒性的确定:
应使用指示细胞完整性和生长情况的指标,在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性,例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况(totalgrowth)。
应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。
6.1.1.3.3剂量设置
至少应设置4个可供分析的浓度。
当有细胞毒性时,其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性。
通常浓度间隔系数不大于。
如最高浓度是基于细胞毒性,那么该浓度组的细胞相对存活率(相对集落形成率)或相对细胞总生长情况应为10%~20%(不低于10%)。
对于那些细胞毒性很低的化合物,最高浓度应是5µ
L/mL,5mg/mL或0.0lmol/L。
对于相对不溶解的物质,其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值。
最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度,因为由于S9等的存在,试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化。
不溶解性可用肉眼鉴别,但沉淀不应影响观察。
6.1.2对照:
在每一项试验中,在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性对照和阴性(溶剂)对照。
6.1.2.1阳性对照:
当使用代谢活化系统时,阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质。
在没有代谢活化系统时,阳性对照物可使用甲磺酸乙酯(ethylmethanesulfonate-EMS)、甲磺酸甲酯(methylmethanesulphonate,MMS),乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea-ENU)等。
在有代谢活化系统时,可以使用3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)、环磷酰胺(cyclophosphamide)N-亚硝基胍(N-nitroso-dimethylamine)、7,12-二甲基苯蒽等。
也可使用其他适宜的阳性对照物。
6.1.2.2阴性对照物:
阴性对照(包括溶剂对照)除不含受试物外,其他处理应与受试物相同。
此外,当不具有实验室历史资料证实所用溶剂无致突变作用和无其他有害作用时,还应设空白对照。
6.1.3细胞:
HPRT位点突变分析常用中国仓鼠肺细胞株(V-79)和中国仓鼠卵巢细胞株(CHO)。
TK位点突变分析常用小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y)和人类淋巴母细胞株(TK6)。
6.1.4培养液:
应根据实验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。
对于V-79或CHO细胞,常用MEM(Eagle)培养基加入10%胎牛血清和适量抗菌素。
对于L5178Y或TK6细胞,常用RPMI1640培养基加入10%马血清和适量抗菌素。
6.1.5活化系统:
同体外哺乳类细胞染色体畸变试验。
6.1.6选择剂:
6-硫代鸟嘌呤(6-TG):
建议使用终浓度为5mg/mL。
三氟胸苷(TFT):
建议使用终浓度为3mg/mL。
6.2试验步骤
6.2.1HPRT位点突变分析
6.2.1.1试验前1d,接种细胞于培养瓶中,置于37°
C孵箱培养。
6.2.1.2试验时吸去培养瓶中的培养液,加入一定浓度的受试物、S9-mix(不加入S9-mix的样品,用培养液补足)及一定量的不含血清培养液,置孵箱中处理3h~6h后,吸去培养液,用Hank’s液洗细胞三次,加入含胎牛血清的培养液。
6.2.1.3在受试物与细胞作用后当天和第3d将细胞按低密度分种,在第7d接种细胞,每个剂量3瓶。
7d后染色以测定细胞存活率。
另将一定数量细胞接种于每个培养瓶中,每个剂量8瓶,3h后加入6-TG(终浓度为5mg/mL),10d后染色,计数突变细胞集落。
6.2.1.4试验结果用x2检验进行统计分析。
6.2.2TK位点突变分析(L5178Y细胞,96孔板法)
6.2.2.1处理:
取生长良好的细胞,调整密度为5×
105/mL,按1%体积加入受试物,37℃震摇处理3小时。
离心,弃上清液,用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍,重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中,并调整细胞密度为2×
105/mL。
6.2.2.2PE0(0天的平板接种效率)测定:
取适量细胞悬液,作梯度稀释至8个细胞/mL,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均1.6个细胞/孔),每个剂量作1~2块板,37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养12d,计数每块平板有集落生长的孔数。
6.2.2.3表达:
步骤6.2.2.1所得细胞悬液作2d表达培养,每天计数细胞密度并保持密度在106/ml以下。
6.2.2.4PE2(第2d的平板接种效率)测定:
第2d表达培养结束后,取适量细胞悬液,按步骤6.2.2.2作梯度稀释并接种96孔板,培养12d后计数每块平板有集落生长的孔数。
6.2.2.5TFT抗性突变频率(MF)测定:
第2d表达培养结束后,取适量细胞悬液,调整细胞密度为1×
104/mL,加入TFT(三氟胸苷,终浓度为3µ
g/mL),混匀,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均2000个细胞/孔),每个剂量作2~4块板,37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养12d,计数有突变集落生长的孔数。
6.2.2.6计算
6.2.2.6.1平板效率(PE0和PE2)
PE=
-ln(EW/TW)
式中:
EW为无集落生长的孔数;
TW为总孔数;
1.6为每孔接种细胞数
1.6
6.2.2.6.2相对存活率(%RS)
相对存活率(%RS)=
PE0(处理)
×
100
PE0(对照)
6.2.2.6.3突变频率(MF)
MF(×
10-6)=
-ln(EW/TW)/n
式中:
n为每孔接种细胞数(2000)
PE2
7结果评价
在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果:
(1)受试物引起突变频率具有统计学意义、并与剂量相关的增加。
(2)受试物在任何一个剂量条件下,引起具有统计学意义,并有可重复性的阳性反应。
阴性结果的判定需在%RS达±
20%(即已产生明显细胞毒性)的情况下未见突变频率显著增加时方可作出。
在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑。
阳性结果表明受试物可引起所用哺乳类细胞的基因突变。
可重复的阳性剂量—反应关系意义更大。
阴性结果表明在本试验条件下,受试物不引起所用哺乳类细胞的基因突变。
8试验报告
试验报告应包括以下内容:
(1)受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量选择(应说明受试物对细胞毒性的测定方法、溶解情况等);
(2)细胞株名称;
(3)实验条件和方法
①代谢活化系统:
制备S9时所用的诱导剂、动物品种和来源、S9mix的配方;
②对照物:
阳性对照物名称和使用浓度;
阴性(溶剂)对照物名称及使用浓度;
③培养液:
所用培养液名称、血清类别和使用浓度;
④接种时的细胞密度以及所用培养瓶的规格;
⑤处理时间:
受试物与实验系统的接触时间;
⑥表达时间;
⑦结果评价方法。
(4)结果
①受试物最高剂量的确定及结果:
包括细胞毒性的测定;
溶解情况;
对pH和渗克分子浓度的影响(如果有影响)。
②试验结果:
试验组和对照组的突变频率及统计结果。
③阳性对照组和阴性对照组(包括常用溶剂,如DMSO)在本实验室历史上的突变频率范围、均值和标准差(说明样品数)。
(5)结论。
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- 关 键 词:
- 体外 哺乳动物 细胞 基因突变 试验