关于生物制药组实训实习报告及心得体会Word文档下载推荐.docx
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19
20
4.pH对提取的酶蛋白的变化
21
六、实验总结
22
实训主要内容:
活菌数的检测、酶活检测、菌液浊度的检测、酶蛋白的提取
组3组员
1
2
表-1
根据实训时间,列出下列表格,以便后续的实验
培养时间(h)
接种时间
取样时间
3
6.248:
30—9:
00
6.2412:
6.2415:
7.5
6.2416:
30
12
6.24下午16:
30(20:
00)
(4C)(30C)
6.258:
16
30-17:
18
6.2511:
6.2514:
24
6.259:
6.269:
27
6.2612:
6.2615:
注:
红色标记为未检测项目。
表格1
试剂的配制、培养基的配制
试剂的配制
所配的试剂名称
所需试剂的质量或体积
0.2M醋酸钠母液200ml
3.28g
0.2M醋酸母液200ml
2.299ml
2mol/L氢氧化钠溶液500ml
40g
1%磷酸二氢钾母液250ml
2.5g
1%七水硫酸亚铁母液250ml
1%硫酸铵母液250ml
0.5%氯化钙母液250ml
1.25g
0.5%七水硫酸镁母液250ml
表格2
由于这些母液上个班配的还没用完,所以也就没再配。
培养基的配制
组3发酵培养基的配制(V总)150ml
试剂
所需(ml)/(g)
所得终浓度
1%磷酸二氢钾
15ml
0.1%磷酸二氢钾
1%七水硫酸亚铁
1.5ml
0.01%七水硫酸亚铁
0.5%氯化钙
7.5ml
0.025%氯化钙
0.5%七水硫酸镁
0.05%七水硫酸镁
1%硫酸铵
0.1%硫酸铵
可溶性淀粉
2.26g
1.5%
蛋白胨
1.52g
1%
氯化钠
0.79g
0.5%
牛肉膏
0.73g
最终培养基pH值为5.0
表格3
营养琼脂培养基的配制
所需质量
营养琼脂培养基
16g
称取营养琼脂培养基16.08g,加水疋容至500ml,煮沸溶解
表格4
醋酸钠-醋酸缓冲液pH
pH
0.2M醋酸钠
0.2M醋酸
4.0
1.8ml
8.2ml
5.0
7.0ml
3.0ml
6.0
9.4ml
0.6ml
表格5
1%可溶性淀粉溶液
称取1.24g可溶性淀粉,用约15ml冷的蒸馏水充分溶解混匀,取约70ml沸腾的蒸馏水,将
已经混匀的淀粉悬浮液倒入沸水中,边倒边用玻璃棒搅拌,使淀粉溶解。
冷却后,用冷的蒸馏水定容到100ml,备用。
实验前的准备
灭菌
将配好的发酵培养基分装于15个规格为100ml锥形瓶,9ml/瓶
250ml锥形瓶+150ml蒸馏水5瓶
将配好的营养琼脂培养基分装于规格为250ml锥形瓶,2瓶
置于高压蒸汽灭菌锅121C,20min灭菌
图0-1
图0-2
23号菌种的培养
取23号菌种在超净工作台内进行接种,100ul/瓶,共3瓶,供后续实验菌种的来源。
置于摇床中培养30C,
100rmp/min。
图0-3
图0-4
固体平板培养基的制备
取灭好菌的营养琼脂培养基,在超净工作台里倒入平板中,大约15ml/个。
供后续检测活菌数使用。
图0-5
图0-6
注意事项:
在配制营养琼脂培养基时,要先加少量水进行溶解搅拌,再加热水进行充分溶解,最后煮沸使琼脂全部溶解,否则琼脂没有溶解就分装,灭菌后就出现上图现象,有的培养基太硬,有的太软。
实验内容及操作
接种培养
根据表2时间表进行接种培养,100ul/瓶,置于摇床30C,100rmp/min培养。
活菌数检测
根据表2时间表进行操作,取菌液100ul+900ul无菌水于EP管中进行连续梯度稀释,然后取100ul在平板
培养基上进行涂布。
放于培养箱中培养,得下表数据。
活菌数随培养时间变化表
时间(hr)
稀释倍数
菌数
平均值
108
1X108
107
9X106
106
9
2X108
7
8.5X106
1.8X108
53
127
5.2X1010
230
109
133
33
2.0X1010
73
6.3X1010
210
23
1.615X1010
未检测
表0-1
图0-5(为6h失败平板)
菌液稀释倍数要合理,在进行用涂布棒涂布的时候,涂布棒在酒精灯上灼烧后一定要冷却,否则会烫死菌种。
涂布要均匀,多来回涂几次,否则就成上图6h失败平板
酶活检测
计算公式:
酶活力(U)={[(A-空白)-(B-空白)-(对照-空白)]XV/t反应}倍数值)X310
根据表2时间表进行对应的时间段酶活的检测,,按照下表进行操作
步骤
空白
对照
A
B
发酵液上清
0ml
100ul
出0
醋酸钠-醋酸缓冲液
400ul
4
1ml
室温放置反应5min
5min
立即加2MNaOH
2ml
8
DNS溶液
100C加热显色
6-8min
冰水冷却
3min
11
补水定容
4.5ml
540nm检测
表0-2
根据上表进行操作得到以下数据
酶活力随培养时间变化
A值(平均值)
B值
酶活力
0.335
0.108
0.107
0.229
10.5
0.649
0.374
0.233
150
0.962
0.630
0.235
204
0.892
0.573
0.214
212
0.832
0.549
0.106
0.207
182
0.809
0.498
18.9
0.660
0.362
17.6
0.606
0.305
0.268
13.9
表0-3
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图0-7
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图0-8
图0-9
在使用仪器时,样品室使用完都要清洗,样品室的石英窗应保持清洁,样品室石英窗不应有污染。
菌液浊度检测
按照培养时间的不同对菌液稀释10倍操作是取0.5ml菌液+4.5ml水,共3只,所测结果取平均值。
对菌
液稀释50倍操作是取1ml菌液+4ml水,再从中取出0.5ml+4.5ml水,即得稀释50倍,共3只,所测结果取平均值。
下表为所得数据
培养时间(hr)
菌液稀释倍数
吸光度值
菌液浊度
0.093
0.93
0.407
4.07
0.657
6.57
50
0.27
13.5
0.38
20.35
0.43
21.5
0.513
25.65
表0-4
图0-10
酶蛋白的提取
取培养菌液于离心管中,进行5000rmp,10min离心。
取上清,加入50ml冰的无水乙醇,放入4C冰箱1h。
5000rmp,20min离心。
弃上清,加入1ml蒸馏水,混匀溶解。
改变醋酸钠-醋酸缓冲液pH进行酶活力检
测,得以下数据
蛋白提取酶活力表
pH值
pH4.0
0.284
1.227
0.991
59
pH5.0
0.267
1.315
0.940
214
pH6.0
0.264
1.383
0.939
286
图0-11
加入的无水乙醇一定是要冰的,不然容易使酶失活。
细菌的染色和镜检
1.滴加少量种子液于干净载玻片上,用镊子置于酒精灯上端干燥。
2.待到种子液干燥后,滴加结晶紫染液于细菌涂抹处,使其布满菌膜,染色1min,用蒸馏水洗去
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- 关于 生物制药 组实训 实习 报告 心得体会