烟草植物组织培养实验报告Word文档下载推荐.docx
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NaOH、1N
HCl
蒸馏水、70%酒精、0.01%升汞
仪器:
1
玻璃杯、1玻璃棒、1pH试纸(5.5-9.0)
1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、1个无菌白瓷板
、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、
酒精灯、解剖刀、镊子
四、试验方法与步骤
4.1MS培养基母液配制
母液
成 分
要求量
浓缩
倍数
称取量(mg)
体积(ml)
配制1升培养基吸收量定容
编号
种类
1
大量元素
KNO3
1900
10
19000
1000
100
NH4NO3
1650
16500
MgSO4·
7H2O
370
3700
KH2PO4
170
1700
2
CaCl2·
2H2O
440
4400
3
微量元素
MnSO4·
4H2O
22.3
2230
ZnSO4·
8.6
860
H3BO3
6.2
620
KI
0.83
83
Na2MoO4·
0.25
25
CuSO4.5H2O4
0.025
2.5
CoCL2.6H2O
4
铁盐
Na2-EDTA
37.3
3730
FeSO4.4H2O
27.8
2780
5
有机物
甘氨酸
2.0
500
盐酸吡哆醇
0.5
盐酸硫铵素
0.1
烟酸
6
肌酸
5000
注意:
1.大量元素根据使用时高10倍数值称取,分别将多种化合物称量后,除CaCl2·
2H2O单独配制外,其它化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解,用玻璃棒搅拌促溶,倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,置小口瓶中保留,贴上标签注明化合物名称(或编号),浓缩倍数,配制日期和配制者姓名,CaCl2·
2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2.微量元素母液配制
按要求浓缩100倍数值称取,分别将多种化合物称量除铁盐(FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA.2H2O)作为一组单独配制外,其它化合物可混合置于烧杯内加少许蒸馏水溶解后,定容在1000ml容量瓶中,置小口瓶中保留,贴上标签。
3.铁盐配制将FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中,加热,(很关键)不停搅拌,溶解后,两液混合,调PH至5.5加水定容至1000ml,置于小口瓶中,贴上标签。
4.有机物母液配制,按母液要求浓缩50倍,除蔗糖按3%单独临时称量外,其它分别称量后,溶解,定容在500ml容量瓶中,置于小口瓶中保留,贴上标签。
5.母液最好在2~4℃冰箱中贮存,尤其是有机类物质,贮存时间不宜过长,无机盐母液最好在一个月内用完,如发觉有霉菌和沉淀产生,就不能再使用。
1.制备母液和营养培养基时,所用蒸馏水或无离子水必需符合标准要求,化学药品必需是高纯度(分析纯)。
2.称量药品采取高灵敏度天平,每种药品专用一药匙。
.生长调整剂母液配制:
为了操作方便,节省时间,生长调整剂也可如同配制母液一样,先配成原液,这么配制培养基时只要稍加计算,按需要量取即可。
不一样药品在配制时若不溶于水,可用少许不一样溶剂先溶解,萘乙酸(NAA),吲哚乙酸(IAA),赤霉素(GA3),2,4-D等生长素和玉米素(ZT)可先用少许95%酒精溶解,然后加水,如溶解不完全再加热。
激动素(KT)和6-苄基嘌呤(BA)可溶于少许1mol/L盐酸中,叶酸需用少许稀氨水溶解。
称取50mg生长调整物质,溶解后,在100ml容量瓶中定容,配制母液每毫升则含有生长调整物质0.5mg,配制后通常要求在低温(0~4℃)保留,配制培养基时如每升(1000ml)需添加生长调整剂物质为0.5mg时,则取1ml母液即可。
4.2培养基配制和灭菌
4.2.1培养培养基配制程序
此次试验使用
(1)愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:
MS+2,4-D
0.5
mg/L
+6-BA
1.0
mg/L;
(2)幼芽增殖培养基:
MS+6-BA
+NAA
0.2
(3)生根培养基:
MS+NAA
mg/L。
注意事项:
上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后,加入对应激素所得,MS固体培养基配置过程在此不作过多赘述
上述培养基均附加3%蔗糖,0.8%琼脂,pH5.8,培养温度25±
2℃,光照强lx。
(一).母液吸收量计算
配制培养基升数
公式1:
母液吸收量=母液体积(CC)×
——————————
母液浓缩倍数
培养基要求含量
公式2:
母液吸收量=———————————(多种生长调整剂)
母液每CC含量
(二)多种母液按次序编号排列
A.大量元素;
B.CaCl2.2H2O;
C.微量元素;
D.铁盐;
E.有机物;
F.生长素萘乙酸(NAA):
配制0.5mg/mlNAA称取50mg,NAA用少许95%酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml;
G..细胞分裂素、激动素(KT)配制0.5mg/mlKT称50mgKT用少许1NHCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
(三) 配制培养基(1000ml)
1.琼脂:
称取5~7g琼脂,加入300ml蒸馏水,加热溶解直至完全溶解为止.
2.蔗糖3%用质量很好白糖替换,称取30g白糖,溶于溶有琼脂300ml蒸馏水中。
3.多种母液吸收(培养基1L)
(1)用50ml量筒量取大量元素母液(A)和CaCl2·
2H2O母液(B)各100ml
(2)分别用10ml移液管或吸管吸收微量元素(C),铁盐(D)母液各10ml
(3)用10ml移液管或吸管吸收有机物(H)10ml
(4)移取激素
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中,混合均匀后,加热至80℃左右,用酸度计或精密PH试纸测定培养基PH通常要求5.8~6.0,过酸过碱则用1NNaoH和1NHCL调整。
二.分装:
用一个接有胶管分装器趁热装培养基,1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中,每个三角瓶约30ml左右(通常占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右)注:
培养基勿碰瓶壁。
三. 包装:
分装好三角瓶用封口膜包扎好,标明培养基代号即可进行灭菌。
用具清理和洗涤:
多种母液按原位置摆整齐,用过量筒,移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤洁净,然后按次序放回原处。
4.2.2培养基灭菌——高压蒸汽灭菌(高压蒸汽灭菌锅使用方法)
具体操作步骤:
1.高压锅放水至平把架;
2.把包扎好培养基装入高压锅;
3.盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.
4.然后接通电源.
5.压力计升至0.05MPa时,打开放气阀,排除冷空气(此步很关键)。
6.排除冷空气后,关闭放气阀,待压力升到0.11MPa位置时,开始计算灭菌时间,具体方法:
当压力锅指针升至0.12MPa时,关闭电源,待指针下降至0.11MPa时接通电源,不停反复此操作过程,维持20分钟。
7.灭菌时间达成20分钟后,除去电源,打开放气阀(注意要逐步放气)待高压锅内空气完全排除后,打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。
8. 经过灭菌营养培养基不宜放置太长,应尽早使用,但为了在使用前能检验培养基有没有微生物污染,可将培养基置于25℃下保留4天,假如培养基需要贮存较长时间,可在4℃低温下保留。
灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多个型号和规格,不管哪种型号,操作步骤都很相近。
进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检验安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气,关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟,保持稳定压力→除热源→逐步打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。
4.3植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌
从外界或室内选择植物材料,都不一样程度地带有多种微生物。
这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。
所以,植物材料必需经严格表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。
1.接种步骤:
第一步:
清理材料→→流水冲洗→→加入吐温(或洗衣粉)清洗→→自来水冲洗
第二步:
对材料表面浸润灭菌:
70%酒精浸10-30秒→→无菌水
第三步:
灭菌剂处理→→0.1-1%升汞5-8min(或其她灭菌剂)
第四步:
无菌水进行冲洗
1.灭菌剂通常要临时配制,现配现用.升汞能够短期储存.
2.对去除较轻易灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3-4次,升汞通常5-8次,每次不少于3min
3.灭菌时要轻轻搅拌,消除气泡,使消毒更根本.
4.灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。
5.灭菌液要充足浸没材料
2.无菌操作可按以下步骤进行:
(1)在接种3天前用甲醛熏蒸接种室,并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌;
(2)在接种前20分钟,打开超净工作台风机以及台上紫外线灯;
(3)接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用试验服,并换穿拖鞋等;
(4)上工作台后,用酒精棉球搽拭双手,尤其是指甲处。
然后搽拭工作台面;
(5)先用酒精棉球搽拭接种工具,再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干;
(6)接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等;
材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行合适切割。
(如叶片
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