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多肽链中一些连续氨基酸序列自发形成有
规律的盘旋,螺距0.54,每圈3.6残基。
β折叠:
由侧向平行的多肽链组成,羰酰O和酰胺H形成氢键。
每条5~8残基。
转角(转环):
由3~4个氨基酸残基组成的紧凑U型,两端多肽形成氢键来转折,大多位于蛋白质表面,形成回折使多肽链重新定向。
二级稳定性取决于多肽链中形成的氢键。
三级:
二级互作产生,由氢键和带有非极性基团侧链的疏水作用。
四级:
具三级结构多肽链形成的多亚基蛋白。
高级间弱相互作用可逆、可塑、可控。
基序(超二级结构)由几个二级结构组成,有特定功能,如锌指
结构域:
蛋白质中具有相对独立功能的模块结构。
激酶域、结合域
蛋白质构象变换:
在不同构象之间的转变。
二、序列复杂性
原核生物(细菌和古细菌)、真核、细胞器基因组
C值:
一个单倍体基因组中DNA总量,每个种具特征C值。
随着生物结构和功能复杂性增加,各分类单元最小基因组的大小随分类地位提高而递增。
C值悖理:
生物复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加。
序列复杂性:
不同序列的DNA总长
复性动力学:
变性复性:
互补单链在一定条件下分开,撤除条件后又恢复双螺旋。
Cot1/2为其实浓度DNA在保温t时间后半数DNA完全复性的数值。
与基因组复杂性成正比。
大肠杆菌为标准。
①快速复性组分、居间复性组分、缓慢复性组分②高度重复序列(卫星DNA):
特点:
⑴由极其相似的重复拷贝首尾相连组成⑵在氯化铯介质中做密度梯度离心形成特异卫星带⑶集中分布在染色体特定区域,如着丝粒和端粒;
中度重复序列:
长散在、短散在序列;
单一序列:
原核生物基因组全部都是。
低等真核大多都是。
基因主要位于单一序列。
证明:
DNA驱动杂交。
将少量mRNA或cDNA标记后与过量DNA混合,对比复性曲线,发现大多标记基因只和单一序列复性。
三、基因家族
DNA成分:
⑴编码初级转录物的全部序列⑵为正确启动转录及转录物加工所必须的序列⑶调节转录速率的。
编码RNA的基因大多为多拷贝。
编码蛋白质的是单拷贝,因为RNA基因每次只转录出一个产物,且均由RNA聚合酶II转录,蛋白质编码基因的显著特征是基因编码序列的非连续性,有外显子和内含子
基因家族:
真核生物基因组起源于同一祖先,由加倍或趋异产生了结构功能相同或相似的基因。
超基因家族:
指起源于共同祖先,由相似DNA序列组成的许多基因亚家族或相似的基因成员构成功能相似的群体。
联合基因:
基因组中一段连续的DNA序列,编码一组关联的重叠功能产物。
异常结构基因:
①重叠基因:
编码序列彼此重叠的基因,含有不同蛋白质的编码序列。
类型:
⑴单个mRNA可编码多种蛋白质⑵由不同启动子转录不同mRNA,各自编码不同蛋白质。
②基因内基因:
一个基因的内含子中包含另一个基因。
③反义基因:
与已知基因编码序列互补的负链编码的基因,对编码基因进行干扰
假基因:
来源于功能基因但已失去活性的序列,有些沉默有些可转录。
重复的假基因、加工的假基因、残缺基因
四、染色体
染色体数目与生物特征无关,与基因组大小也无直接关联
核小体:
念珠状→30nm纤丝→中期染色体
着丝粒:
将DNA复制后产生的2个染色体连接在一起,纺锤丝附着的区域。
端粒:
保护染色体末端免受内源核酸酶的破坏,为线性染色体的末端复制提供基础,保持染色体完整性。
复制起点:
每个复制子都有一个
质粒:
另一种独立的遗传物质,含一些非必要基因,是附加的遗传成分
五、基因组
核基因组:
24条;
线粒体基因组:
环状;
原核真核基因组比较:
复杂性较高的生物基因组的结构大多臃肿松弛,具大量重复序列。
原核则相反。
原因:
⑴原核不含内含子⑵极少重复⑶基因数量少
第二章遗传图
基因组作图:
在长链DNA分子的不同位置特征性的分子标记,再将包括这些序列的克隆进行连锁定位,绘制基因组图。
测序方法:
①作图法:
绘制高密度分子标记遗传图和大分子DNA克隆重叠群覆盖的基因组物理图,然后根据分子标记所在位置将遗传图和物理图彼此衔接绘制基因组整合图。
由上而下的测序。
②鸟枪法:
全基因鸟枪法随机测序,然后将序列重叠片段构建重叠群,然后以大分子DNA克隆为基准,最后以分子标记为基点将归并的DNA片段锚定到染色体上。
由下而上。
一、遗传图与物理图
①遗传作图:
采用遗传分析方法将基因或DNA分子标记标定在染色体上构建连锁图称为遗传连锁图。
单位为厘摩cM
②物理作图:
采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置所构建的位置图。
单位厘镭cR
共同之处是确定基因或DNA分子标记在染色体上的排列位置,相互校正获得基因组图
二、作图标记
DNA标记:
①限制性片段长度多态性(RFLP):
由于同源染色体同一区段DNA序列的差异,用限制酶处理,可产生长度不同的限制性片段。
特征:
⑴处于染色体上的位置相对固定⑵同一亲本及其子代相同位点多态性片段特征不变⑶同一凝胶电泳可显示同一位点的不同多态性片段,具共显性特点。
②简单序列长度多态性(SSLP):
同一位点重复序列的重复次数不同,包括:
小卫星序列(可变串联重复);
微卫星序列(SSR)。
后者应用普遍居多,原因:
⑴小卫星序列在基因组中分布不均匀,而微卫星序列分布在整个基因;
⑵微卫星便于PCR,小卫星重复单位较长,加之许多重复序列串接,不利于扩增。
③单核苷酸多态性(SNP)
三、做图方法
连锁分析:
采用一组分子标记构建遗传图的方法主要依赖于连锁分析。
重组率:
交换使2个连锁基因分开的频率应同它们在染色体上所处位置的距离成正比,因为距离越远,位于其间的配对区段越多,交换机会越大。
重组热点:
染色体的各个区段交换频率有差别,近端粒区和远着丝粒区有较高重组率。
男女之间染色体交换频率在同一位点也有差异,各有一个性别专一重组热点
连锁不平衡:
群体遗传学中有关两个或多个座位的等位基因成员出现在个体中的非随机的关联性,彼此位置靠近的基因座更易表现。
不同模式生物连锁分析:
有性杂交实验:
根据需要有计划的实施杂交方案进行分析;
系谱分析不能有计划的进行试验,只能收集家系成员的相关资料;
DNA转移:
不发生减数分裂的生物。
如细菌。
应采用部分二倍体技术方法:
⑴接合:
2细菌接触,供体转移DNA到受体⑵转化:
供体细胞释放DNA,受体摄取整合⑶转导:
以噬菌体为媒介
共分离:
基因附近如果有一个紧密连锁的分子标记,在细胞减数分裂时分子标记与基因之间由于相距太近很少有机会交换。
有性繁殖的后代,分子标记与连锁的基因有最大的可能同时出现在同一个体中。
四、人类遗传图绘制:
1987第一份RFLP连锁图,400个标记,来自21个家庭;
1994第二份5800标记。
第三章物理图绘制
1.物理图定义:
直接检测DNA标记在染色体上的实际位置
2.遗传分析图缺点:
①分辨率有限②覆盖面和准确率低准③分子标记的排列受其他因素影响,出现误差多。
3.二者异同:
位点都有,排列顺序相同(个别有差错);
位点相对位置不同。
4.物理做图方法:
①限制性作图:
用限制性酶切位点标定。
限制:
⑴无法区分大小相同片段⑵限制点多时大量片段无法排序。
稀有切点限制酶:
该酶在基因组中识别的碱基顺序只有少量,可产生大段片段。
注:
⑴识别碱基越长,片段越大,但受非特异顺序干扰⑵大小受识别位点碱基大小干扰⑶有些识别位点较长⑷受DNA甲基化状态影响
大分子片段的分离:
脉冲凝胶电泳:
用方向不断变化的电场,分离运动受阻的分子。
②基于克隆的基因组作图:
克隆DNA片段的重叠来构建重叠群;
大分子DNA克隆载体:
酵母人工蛋白YACBAC载体:
细菌人工染色体。
源于大肠杆菌F质粒,特点⑴单拷贝复制,不发生嵌合⑵分子质量大,有较大克隆容量。
⑶便于大规模生产
重叠群组建:
Pr步移法:
从文库中挑选一个克隆,用末端序列纯化为探针,再在文库中找第二个克隆,依次直到重叠群完成。
缺点:
步移缓慢,仅适合小基因组。
克隆指纹排序:
指纹:
克隆的DNA序列具有的特定的DNA片段组成。
分类:
⑴限制带型指纹⑵重复序列DNA指纹⑶重复序列DNAPCR⑷STS作图:
根据选定的某个STS序列设计专一性引物,可对大量单个克隆进行PCR检测,凡是能扩增出挑带的克隆均含有序列重叠的插入子。
原理:
一、基因组中单序列标签位点STS都有唯一已知序列组成;
二、在染色体上位置确定;
三、相邻STS是机械连接的,在外力或酶切作用下断裂时两STS出现在同一片段的几率与距离负相关。
寻找SST方法:
⑴表达序列标签EST⑵SSLP⑶随机基因组序列。
辐射杂种作图:
辐射杂种:
含有另一种生物染色体片段的啮齿类细胞。
原理:
人体细胞暴露在X射线中可随机断裂,辐射越大片段越小。
此时将死细胞和鼠细胞融合,有些染色体片段会整合到鼠染色体中。
作图方法:
两个标记原本越远,发生断裂的可能性越高,随机整合后再同一杂种细胞中比例和连锁关系成正比。
图距确定:
厘镭,DNA分子暴露在NradX射线剂量下两个分子标记间发生1%断裂的频率。
③荧光位点原位杂交:
用荧光标记的探针杂交。
通过原位杂交的方法可将基因或DNA分子标记定位在染色体的某一区段,来绘制染色体位置图。
靶子是完整染色体。
目标必须为单链。
④序列标签位点:
PCR或分子杂交将小段DNA定位。
第四章基因组测序及序列组装
1.第一代:
⑴以待测DNA为模板,根据碱基互补用DNA聚合酶体外合成新链。
⑵新链中带有标记,可制备末端带有标记的DNA单链。
链终止法:
通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的序列。
合成的互补单链可在任一位置终止。
原理:
反应中加入了少量的双脱氧核糖核苷酸,DNA聚合酶不能区分dNTP和ddNTP,因此可混入DNA单链中。
但其核糖基3’c上连接的是H而不是OH,因此不能继续脱水缩合而终止新链合成。
技术要点:
①双脱氧核糖核苷酸。
电泳后最前沿DNA表示最小DNA链,是第一个ddNTP掺入位置。
依次往后间隔为1个碱基。
由下往上依次阅读。
②DNA聚合酶要求:
⑴高酶活性。
使得在终止合成前酶不会脱离模板。
⑵无5’→3’外切核酸酶活性。
⑶无3’→5’外切活性。
不可校对。
③要求单链为模板。
制备单链方法:
⑴将DNA克隆到质粒载体中,再碱变性或热变性解旋。
⑵以M13载体克隆单链;
⑶以噬粒载体克隆;
⑷PCR。
④引物的序列决定了DNA测序起点。
需终止单链合成而不能连续测序;
测序长度有限,因需电泳分离DNA单链,分子量越大越难。
化学降解法:
用化学试剂处
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