BDNF TrkB 在岛叶慢性电点燃大鼠海马中的表达及与学习记忆的关系Word下载.docx
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点燃2周点燃组避暗试验结果的LT为(48.87±
3.42s)、EN为(2.75±
0.99次)、点燃3周点燃组避暗试验结果的LT为(48.71±
2.77s)、EN为(2.75±
1.15次),与对照组(即点燃0周)相比学习记忆功能增强(P<0.05),点燃4周后与对照组比学习记忆功能明显下降(P<0.05)。
BDNF、TrkB表达均在24h达到高峰(P<0.05),空白对照组、假手术组无明显变化。
组内比较,峰值及增幅均出现在2~3周内(P<0.01),4周后较前几周组明显下降(P<0.05)。
结论岛叶电点燃大鼠学习记忆功能与BDNF、TrkB在海马中表达总变化趋势一致。
BDNF、TrkB与岛叶点燃大鼠学习记忆功能密切相关。
关键词:
岛叶;
癫痫;
BDNF;
TRKB;
海马;
避暗试验;
学习记忆
中图分类号:
文献标识码:
A
TheexpressionofBDNFandTrkBinrathippocampusandtherelationshipwithlearning-rememberingabilityinchronicelectronicignitionofinsularlobe.
XUWen-zhong,WANGFeng,ZHANGPei-song,RENShuang-lai,QIJiang-hua,,SUNTao.NingxiaMedicalUniversity,KeyLabofCraniocerbralDisease,NingXiaHuiAutonomousRegion,Yinchuan750004,China
Correspondingauthor:
SUNTao,Email:
suntao@.
【Abstract】ObjectiveTostudytheexpressionofactiveSkeletonAdjustmentProtein(BDNF、TrkB)inrat’sHippocampusinthemodelofinsularchronicelectricity-ignitingepilepsyandinvestigatetherelationbetweenBDNF、TrkBandlearning-rememberingabilityintheepilepticrat.
Methods:
TodivideadultSDratsrandomlyintomodel,shamandcontrolgroup,respectively.ThePassiveavoidancetestwasemployedtotestlearning-rememberingabilityofratsandImmunohistochemistryandwesternblotwasusedtodeterminetheexpressionofBDNF、TrkBinthehippocampusandRT-PCRwasexploitedtocheckthegeneexpressionofthetwofactors.Result:
Thereisnobigdifferenceoflearning-rememberingabilityofratsamongtheignitinggrouporcontrolgroupandshamgroups(P>
0.05)inthefirstweekafterinsularchronicignitionwhenpassiveavoidancetestwasexamined.Theincreasedlearning-rememberingabilityappearedinthe2ndweek(LT:
48.87±
3.42s;
EN:
2.75±
0.99),3rdweek(LT:
48.71±
2.77s;
2.75±
1.15)aftertheignition(P<
0.05).Itwasdeclinedinthe4thweek.AsfortheexpressionofBDNFandTrkBthepeakvalueoccurredinthe24hours(P<
0.05)withintheexperimentalgroups,itkeptincreasinginthe2ndand3rdweekandthendroppedinthe4thweek,buttherewasnostatisticaldifferenceamongthecontrolandshamgroups(P>
0.05).Conclusion:
ThegeneraltendencyoftheexpressionofBDNF、TrkBinrathippocampusafterthechronicinsularelectricityignitionwasconsistentwiththelearning-rememberingabilityofepilepsyrats.BDNFandTrkBarecloselyassociatedwiththelearning-rememberabilityforepilepsyrats.
Keywords:
Insula,epilepsy,BDNF、TrkB,hippocampus,learningandrememberingability,Passiveavoidancetest
癫痫是中枢神经系统功能失常脑科临床综合征,可引起认知功能损害。
2008年BekinschteinP等研究发现脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactorBDNF)及其特定受体酪氨酸蛋白激酶受体B(TyrosinereceptorkinaseB,TrkB)在癫痫的学习记忆中起到重要的作用,并将持久的记忆储存海马[1-3],但机制尚不明确。
作为人类第五脑叶的岛叶,对记忆、学习起着至关重要的作用[3-5]。
本研究应用避暗实验检测岛叶癫痫大鼠学习记忆功能,检测BNDF、TrkB在其海马中表达,探讨BDNF、TrkB在岛叶癫痫大鼠学习记忆的作用,初步了解岛叶起源癫痫引起认知损害的机制。
1材料与方法
1.1主要试剂实验用抗体羊抗兔抗BDNF、TrkB购自SANTACRUZ公司,蛋白实验用试剂盒均购自南京凯基生物有限公司。
硝纤膜及ECL发光试剂盒购自PIECE公司。
RT-RCR试验用试剂盒购自上海生物工程公司。
1.2实验动物及分组健康6~8周SD雄性大鼠180只,体重(225±
15)g,由宁夏医科大学动物中心提供,随机分为:
岛叶点燃组、岛叶假手术组、空白对照组。
点燃组再分为:
0周(从点燃当天到点燃6d)、1周、2周、3周、4周等亚组。
每亚组再取1h、12h、24h时间点检测。
模型点燃成功率为92.3%,模型成功率与大鼠体重未见相关性(P>0.05)。
每组大鼠n=6只
1.3模型制作大鼠麻醉后,固定于SR-5R型脑立体定向仪,正中切口,以前囟为参考点;
于枕、额骨区安放加固螺钉3个,螺钉兼做接地电极;
参考Paxinos&
Watson图谱(左侧岛叶:
前囟前1.2mm,旁开5.5mm,硬膜下5.5mm),本实验电极置于左侧岛叶(电极植入左右侧差异性无相关文献报道),定向仪辅助下,垂直植入电极,恢复7d进行后续试验。
后放电阈值(ADT):
单通道刺激器AM-2100型电子刺激器进行刺激,Alpha-Lab4通道信号采集及处理系统记录大鼠脑电活动,刺激强度由90µ
A开始,每次增加20µ
A,间隔3min,直至出现3s以上的皮层电流,此强度即为ADT。
从测定ADT的第1天起,每日刺激两次,强度为ADT的1.5倍,同时观察大鼠脑电变化且记录发作强度。
癫痫发作强度按Racine分级评分。
连续出现5次5级发作即为点燃成功[1]。
点燃后大鼠会出现自发癫痫发作,但在点燃后长时间(约1月)不受任何刺激下,不再出现癫痫发作,这是模型局限性。
为了保持模型是癫痫鼠状态,在点燃后1周、2周、3周、4周同一时间点分别给予一次ADT的1.5倍刺激,使其5级发作一次。
假手术组只植入电极,不行电刺激。
1.4避暗试验全部大鼠均采用避暗试验法进行学习记忆能力测试。
大鼠在实验箱内适应2min,实验箱分明、暗两室,两室间有一直径10cm的圆孔,暗室底部有可通电铜栅。
将大鼠背对暗室的洞口放入明室,并开始计时,大鼠很快进入暗室,此时接通暗室电源,给予直流电电击大鼠,其会逃出暗室,训练5min。
24h后,在暗室铜栅通电的情况下,将动物置于明室,记录大鼠从明室第1次进入暗室的时间为潜伏期(LT),然后记录10min大鼠进入暗室的次数即穿梭次数(EN),LT和EN共同作为记忆成绩。
1.5标本收集大鼠单笼饲养,避暗试验后用乙醚麻醉后一部分断头迅速取出海马组织,至-80℃冰箱以备用,另一部分用4%多聚甲醛灌注后取全脑放于蔗糖溶液梯度脱水,应用OTC(Sakura,USA)包埋,-80℃冰箱保存以备组织切片用。
1.6免疫组化检测采用SABC免疫组化法,兔抗鼠BDNF(1:
50)、兔抗鼠TrkB(1:
75),二抗(1:
600),常规免疫组化操作,检测海马中BDNF、TRKB表达,应用KS400图像分析系统进行定量分析,每张切片随机取6个中倍视野,取阳性细胞百分率。
1.7RT-PCR检测mRNA表达应用Trizol试剂常规一步法提取海马组织的总RNA,逆转录合成cDNA。
参照文献和核对得到PCR特异性引物。
引物合成有上海生工合成,逆转录反应体系为模板mRNA5μg,OligodNTP1.0μl,加双蒸水至20μl,70℃5min,置冰,加入5×
逆转录缓冲液5μl、10mmol/LdNTPmixtrue1.25μl,抑制剂0.5μl,AMV逆转录酶1.0μl,双蒸水2.25μl,42℃1h,70°
10min。
PCR反应体系(50μl):
10×
Buffer5.0μl,10mmol/LdNTP1.0μl,20mmol/L引物1.0μl,Taq酶0.5μl,CDNA模板1.0μl,双蒸水38.5μl。
BDNF的引物序列:
上游:
5'
-C
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